胎鼠間充質(zhì)干細(xì)胞移植緩解小鼠體力疲勞的研究*

劉成成， 祝愛(ài)珍， 周艷華， 劉革修， 何冬梅， 譚廣銷， 陳卓銘

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院血液病研究所，2附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，廣東廣州510632)

抗疲勞一直以來(lái)是研究的熱點(diǎn)，已有研究報(bào)道顯示，許多天然物質(zhì)可以有效緩解和抵抗疲勞，如辣椒堿，可升高血液中兒茶酚胺的濃度，延長(zhǎng)小鼠耐力［1］;茶多酚，可促進(jìn)脂肪燃燒，降低運(yùn)動(dòng)所致的氧化應(yīng)激，緩解體力疲勞［2］;紅景天苷，通過(guò)影響運(yùn)動(dòng)過(guò)程中自由基的生成和能量代謝起到抗疲勞作用［3］。但這些物質(zhì)是否能應(yīng)用于臨床仍需進(jìn)一步研究。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多種分向潛能的細(xì)胞，作為基質(zhì)細(xì)胞中的一種，可以分泌各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子［4］，具有自我復(fù)制、免疫調(diào)控及促進(jìn)造血干細(xì)胞植入等特點(diǎn)［5－6］，臨床上已有嘗試將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用于重癥肌無(wú)力患者，有患者表現(xiàn)出明顯的臨床緩解，但至今沒(méi)有研究報(bào)道能解釋這一現(xiàn)象，也未有間充質(zhì)干細(xì)胞在緩解、抵抗體力疲勞方面的研究，因此，本研究目的是為了明確間充質(zhì)干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的抗疲勞作用并探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 孕13.5d BALB/c小鼠4只、6月齡雌性BALB/c純系小鼠90只，SPF級(jí)，體重(20±2)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):(粵)2008－0002，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行，在無(wú)菌條件下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、膠原酶Ⅳ和胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco;胎牛血清購(gòu)自HyClone;血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血乳酸(blood lactic acid，BLA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肝糖原和肌糖原測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)購(gòu)自Visual Sonics。

2 方法

2.1 MSCs的分離培養(yǎng) 引頸處死孕13.5d BALB/c小鼠，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒，無(wú)菌取出胎鼠，去除胎鼠頭、尾、四肢及內(nèi)臟，PBS洗滌數(shù)次，于37℃、0.1%膠原酶Ⅳ消化獲得細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞離心，PBS洗滌3次，以1×109/L密度接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后全量換液，棄非貼壁細(xì)胞。細(xì)胞融合達(dá)80%，用0.25%胰酶消化，按1∶3傳代;P5代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和成骨成脂分化鑒定。

2.2 MSCs移植 86只小鼠隨機(jī)分為3組，安靜對(duì)照(nonswimming)組18只，單純運(yùn)動(dòng)(swimming control)組34只，MSCs+運(yùn)動(dòng)(swimming+MSCs)組34只，其中MSCs運(yùn)動(dòng)組尾靜脈輸注第5代MSCs(每只5×106)進(jìn)行干預(yù)，安靜對(duì)照組和單純運(yùn)動(dòng)組輸注同體積生理鹽水1 mL。

2.3 負(fù)重游泳試驗(yàn) 單純運(yùn)動(dòng)組和MSCs運(yùn)動(dòng)組 各8只小鼠，于移植MSCs 24 h后進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)，游泳箱水深38 cm，水溫保持在(25.0±0.5)℃，小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，記錄小鼠從游泳開(kāi)始至力竭的時(shí)間(即小鼠失去協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，10 s內(nèi)沒(méi)能浮出水面的時(shí)點(diǎn))，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠取出，毛巾拭干。

2.4 血尿素氮、肝糖原、肌糖原水平及各組織中SOD活性、MDA含量的測(cè)定 安靜對(duì)照組、單純運(yùn)動(dòng)組和MSCs+運(yùn)動(dòng)組各18只小鼠，于移植MSCs 24 h后，在水深38 cm，水溫(25±0.5)℃的游泳箱里游泳60 min后，一部分小鼠用于測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)，另一部分用于檢測(cè)心功能。戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，內(nèi)眥靜脈迅速取血0.5 mL，待血液凝固后離心，測(cè)定血尿素氮的含量。取腦組織、肝臟、股四頭肌，液氮冰凍，－80℃保存，待測(cè)時(shí)按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝糖原、肌糖原水平、SOD活性和MDA含量。

2.5 心功能的評(píng)估 用于檢測(cè)心功能的小鼠游泳60 min后休息30 min，Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)后的心臟功能，超聲測(cè)量指標(biāo)為:(1)心率(heart rate，HR);(2)每搏輸出量(stroke volume，SV)，根據(jù)主動(dòng)脈瓣血流速度－時(shí)間積分(velocity－time integral，VTIa)計(jì)算SV，計(jì)算公式為SV=VTIa×ACSA，其中ACSA為在胸骨旁長(zhǎng)軸切面所測(cè)主動(dòng)脈瓣環(huán)水平的橫切面積;(3)心輸出量(cardiac output，CO)，指每分鐘左心室排出的血流量，即 CO=SV×HR;(4)左室舒張期容積(left ventricular diastolic volume，LVDV)。

2.6 血乳酸含量測(cè)定 單純運(yùn)動(dòng)組和MSCs+運(yùn)動(dòng)組各8只小鼠在水深38 cm，水溫(25±0.5)℃，水流8 L/min的游泳箱里游泳10 min，分別于游泳前、游泳后0、10 min尾靜脈各取血20 μL，于系統(tǒng)稀釋液中，血乳酸分析儀測(cè)定各組血乳酸的含量［7］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 MSCs體外培養(yǎng)的生物學(xué)特點(diǎn)

原代胎鼠細(xì)胞呈梭型、多角形貼壁生長(zhǎng)，散在、集落式分布，傳代后的細(xì)胞主要呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)較原代均一，呈漩渦狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。第5代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，表達(dá)CD44和CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD45，能向成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞分化，具備MSCs基本特點(diǎn)。成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)被茜素紅染色的鈣結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)胞漿中有紅色脂滴。

Figure 1.Morphology of MSCs of the fifth passage(×40).圖1 第5代胎鼠MSCs形態(tài)學(xué)觀察

Figure 2.Alizarin red staining of MSCs following osteogenic induction(×200).圖2 MSCs的成骨分化

Figure 3.Oil red O staining of MSCs following adipogenic induction(×200).圖3 MSCs的成脂分化

2 實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況觀察

移植MSCs后的小鼠變得活潑好動(dòng)，食欲略有增加，精神狀態(tài)較未移植MSCs的小鼠要好。

3 MSCs對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

移植MSCs 24 h后，MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為(1 890±83)s，與單純運(yùn)動(dòng)組［(1 228±72)s］相比有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這說(shuō)明移植MSCs能顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，緩解體力疲勞，提高運(yùn)動(dòng)耐力。

4 MSCs對(duì)體力疲勞小鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)的影響

4.1 血尿素氮、肝糖原和肌糖原含量變化 小鼠進(jìn)行游泳試驗(yàn)后測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)，MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠運(yùn)動(dòng)后血尿素氮明顯低于單純運(yùn)動(dòng)組，雖然較安靜對(duì)照組有所升高，但升高的幅度較小，而單純運(yùn)動(dòng)組小鼠在運(yùn)動(dòng)后血尿素氮較安靜對(duì)照組明顯升高;MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠肝糖原和肌糖原含量較單純運(yùn)動(dòng)組顯著提高，而單純運(yùn)動(dòng)組小鼠在游泳實(shí)驗(yàn)后，與安靜對(duì)照組相比肝糖原和肌糖原均顯著下降，見(jiàn)表1，說(shuō)明MSCs移植能減少小鼠機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化供能，降低血尿素氮的生成，增加肝糖原和肌糖原的合成，能源物質(zhì)儲(chǔ)備增加，則耐力運(yùn)動(dòng)更為持久。

表1 移植MSCs對(duì)體力疲勞的鼠生化指標(biāo)的影響Table 1.Effects of MSC transplantation on the levels of biochemical indexes in fatigue mice(±s.n=8)

表1 移植MSCs對(duì)體力疲勞的鼠生化指標(biāo)的影響Table 1.Effects of MSC transplantation on the levels of biochemical indexes in fatigue mice(±s.n=8)

*P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs non － swimming group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs swimming control group.

Glycogen(mg/g)Liver Muscle Non－swimming 6.41±1.65 27.49±1.74 5.12±1.09 Group BUN(mmol/L)Swimming control 11.73±1.86## 14.63±1.58## 3.34±0.96*Swimming+MSCs 7.96±1.58＊△ 24.92±1.94＊△△ 4.85±0.84△

4.2 各組織SOD活性和MDA含量 與單純運(yùn)動(dòng)組比較，MSCs+運(yùn)動(dòng)組肝臟、肌肉組織和腦組織SOD活性升高，說(shuō)明移植MSCs提高了機(jī)體的抗氧化能力。單純運(yùn)動(dòng)組肝臟和肌肉組織中MDA含量較安靜對(duì)照組有所升高，但腦組織變化不明顯，說(shuō)明腦組織具有一套完善的自身調(diào)控體系，而MSCs+運(yùn)動(dòng)組肝臟和肌肉組織MDA含量均較單純運(yùn)動(dòng)組低，且接近安靜對(duì)照組，見(jiàn)表2，說(shuō)明移植MSCs能減少M(fèi)DA的生成。

表2 移植MSCs對(duì)體力疲勞的小鼠各組織MDA含量、SOD活性的影響Table 2.Effects of MSC transplantation on MDA level and SOD activity in fatigue mice(±s.n=8)

表2 移植MSCs對(duì)體力疲勞的小鼠各組織MDA含量、SOD活性的影響Table 2.Effects of MSC transplantation on MDA level and SOD activity in fatigue mice(±s.n=8)

*P ＜0.05，##P ＜0.01 vs non －swimming group;△P ＜0.05 vs swimming control group.

)］Brain Liver Muscle Brain Liver Muscle Non － swimming 1.07 ±0.24 1.89 ±0.22 1.79 ±0.23 Group MDA［μmol/(g protein )］SOD［103U/(g protein 1.35 ±0.32 4.69 ±0.89 1.15 ±0.25 Swimming control 1.13 ±0.12 3.07 ±0.26* 2.59 ±0.15* 1.87 ±0.24* 5.87 ±0.67## 1.68 ±0.17*Swimming+MSCs 1.06 ±0.20 2.15 ±0.29＊△ 1.97 ±0.23△ 1.95 ±0.19* 7.72 ±0.72＊△ 1.89 ±0.30△

5 MSCs對(duì)小鼠心功能的影響

在小鼠體力疲勞的狀態(tài)下測(cè)量心臟功能各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果顯示MSCs運(yùn)動(dòng)組小鼠心臟室壁結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有變化，但心臟輸出量、每搏輸出量、左室舒張期容積均較單純運(yùn)動(dòng)組小鼠高，心率較單純運(yùn)動(dòng)組低，說(shuō)明MSCs移植能改善心功能，增強(qiáng)心臟泵血，使運(yùn)動(dòng)過(guò)程中相關(guān)組織器官血供增加，延長(zhǎng)耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)間，見(jiàn)表3。

表3 小鼠心臟超聲結(jié)果比較Table 3.Comparison of echocardiography of the mice among the 3 groups(±s.n=10)

表3 小鼠心臟超聲結(jié)果比較Table 3.Comparison of echocardiography of the mice among the 3 groups(±s.n=10)

*P ＜0.05 vs swimming control group.

Group Heart rate(min－1) Stroke volume(μL) Cardiac output(mL/min) Left ventricular diastolic volume(μL)Non － swimming 383.00 ±9.55 49.54 ±17.12 18.97±4.82 52.98 ±10.05 Swimming control 411.39 ±11.06 50.39 ±16.73 20.73 ±4.26 53.56 ±9.64 Swimming+MSCs 405.04 ±12.47 54.71 ±14.59* 22.16 ±3.25* 54.93 ±9.36*

6 MSCs對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)前后血乳酸的影響

在水流8 L/min的游泳箱里游泳10 min后，單純運(yùn)動(dòng)組小鼠血乳酸較運(yùn)動(dòng)前明顯增加，休息10 min后血乳酸水平有所下降，但仍高于運(yùn)動(dòng)前;MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸含量也有升高，但較單純運(yùn)動(dòng)組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，休息10 min后MSCs+運(yùn)動(dòng)組小鼠血乳酸下降明顯，接近運(yùn)動(dòng)前的數(shù)值，說(shuō)明移植MSCs能減少小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸的堆積，促進(jìn)乳酸分解，對(duì)延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞具有積極作用，見(jiàn)表4。

表4 移植MSCs對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)過(guò)程中血乳酸的影響Table 4.Effect of MSC transplantation on blood lactic acid level in mice(mmol/L.±s.n=8)

表4 移植MSCs對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)過(guò)程中血乳酸的影響Table 4.Effect of MSC transplantation on blood lactic acid level in mice(mmol/L.±s.n=8)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs swimming control group.

Group Before swimming 0 min after swimming 10 min after swimming Swimming control 3.86±0.39 7.16±0.63 6.26±0.52 Swimming+MSCs 3.67±0.41 6.45±0.42# 4.37±0.43##

討 論

運(yùn)動(dòng)能力除了直接與骨骼肌功能密切相關(guān)外，還與機(jī)體心肺功能有著密切關(guān)系。心肺系統(tǒng)功能越強(qiáng)則供應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)和氧氣越多，一方面可以增加有氧代謝以最大限度滿足肌肉的能量需要，進(jìn)而減少乳酸的生成、并促進(jìn)其排出以減少堆積，另一方面則減少糖原和蛋白質(zhì)的消耗，增加肝糖原和肌糖原的儲(chǔ)備［8］，減少血清尿素氮的生成。

本研究結(jié)果不僅證實(shí)了移植胎鼠MSCs可以延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，緩解體力疲勞，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力，而且進(jìn)一步分析了其機(jī)制:移植MSCs明顯增強(qiáng)小鼠的心功能，同時(shí)降低血尿素氮和血乳酸水平，增加肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備等。該研究結(jié)果可能與MSCs獨(dú)特的生物學(xué)活性有關(guān)，即MSCs不僅具有多向分化潛能，而且可分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子［9］。胎鼠間質(zhì)干細(xì)胞作為干細(xì)胞中的一種，較成體干細(xì)胞原始，具有更強(qiáng)的增殖和分化潛能，且免疫原性低，不易發(fā)生排斥反應(yīng)，能更好地發(fā)揮其作用。本課題組已有研究顯示通過(guò)移植胎鼠間充質(zhì)干細(xì)胞可以延緩機(jī)體衰老、改善心臟功能［10］，結(jié)合課題組前期報(bào)道結(jié)果，則可以進(jìn)一步解析研究中心功能增強(qiáng)的原因。目前有大量研究資料顯示，MSCs不僅可以分化為肺上皮細(xì)胞，而且可以分泌多種因子，促進(jìn)肺毛細(xì)血管的再生，這些均能改善機(jī)體肺功能［11－12］。心肺功能增強(qiáng)則為運(yùn)動(dòng)時(shí)提供了足夠的氧和能量，增加了有氧代謝，減少糖酵解的無(wú)氧代謝，增加能量的有效利用，相應(yīng)地減少了乳酸的生成、降低糖原和蛋白質(zhì)的消耗，增加肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備，減少血尿素氮和MDA的生成，有利于維持機(jī)體機(jī)能狀態(tài)、增加其運(yùn)動(dòng)耐力。心肺功能增強(qiáng)，血液循環(huán)加快，還可以增加肝臟等重要臟器供血，增強(qiáng)肝臟合成各種能源物質(zhì)的能力，如肝糖原、肌糖原，促進(jìn)了有害代謝產(chǎn)物的分解，如血尿素氮、肌肉和肝臟的MDA、血乳酸等，同時(shí)可以減少組織細(xì)胞缺氧損傷，這些都有利于緩解體力疲勞，提高機(jī)體耐力。

移植MSCs使得小鼠心肺系統(tǒng)功能得到整體改善，機(jī)體耐力更持久。再者，有文獻(xiàn)資料顯示，移植MSCs可使得小鼠體內(nèi)SOD活性增強(qiáng)，清除氧自由基、抗氧化的能力增強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致，這從另一個(gè)方面也緩解了體力疲勞。

總之，本研究結(jié)果為現(xiàn)今指導(dǎo)臨床上肌無(wú)力患者的治療以及緩解中老年體弱者疲勞提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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