脂氧素A4、保護(hù)素D1、ResolvinD1抑制多種激動(dòng)劑引起的NFκB的活化

鮑華燕，嚴(yán) 君，李 珂，劉 鵬(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京100050)

炎癥是多種疾病發(fā)生發(fā)展的基本病理過(guò)程，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)造成機(jī)體自身組織的損傷。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NFκB)是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)多種免疫和炎癥相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄［1］，受 NFκB調(diào)控的炎癥蛋白包括 MCP-1、ICAM-1、TNFα等［2］。

熱休克蛋白(heat-shock protein，HSPs)、高遷移率族蛋白(high-mobility group protein B，HMGB)1、S100蛋白均可以刺激胞內(nèi)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性因子釋放［3～5］。脂氧素、保護(hù)素、Resolvin是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類對(duì)于炎癥的轉(zhuǎn)歸具有重要調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)［6，7］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究 LXA4、ProD1和RvD1對(duì)NFκB活性的影響，為其在制備抗炎藥物中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰酶和LPS均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Glo-Max 96微孔板發(fā)光檢測(cè)儀和熒光素酶檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，NFκB p65抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司，TNFα ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，HSP70購(gòu)自加拿大StressMarq公司，HMGB1購(gòu)自美國(guó)R＆D公司，S100A4購(gòu)于北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，LXA4、ProD1和RvD1均購(gòu)自美國(guó)Cayman公司，細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白定量試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 穩(wěn)定表達(dá)NFκB熒光素酶報(bào)告基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中加入10%新生牛血清，37℃、5%CO2。

1.3 細(xì)胞分組及處理 將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用胰酶消化處理后，顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞密度，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液置于96孔板內(nèi)，控制細(xì)胞數(shù)量約為1×104個(gè)/孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中約24 h待細(xì)胞貼壁后備用。

將細(xì)胞分為3大組:空白對(duì)照組，細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)單純加入 DMEM培養(yǎng)液;LXA4/ProD1/RvD1+ LPS/HSP70/HMGB1/S100A4組，細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)首先分別加入終濃度為100 nmol/L的LXA4/ProD1/ RvD1預(yù)處理CHO細(xì)胞30 min，然后分別加入終濃度為1 μg/ml的LPS/HSP70/HMGB1/S100A4對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激;單純LPS/HSP70/HMGB1/S100A4組，細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)與上組細(xì)胞同一時(shí)間分別加入終濃度為1 μg/ml的LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激細(xì)胞。各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理24 h后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NFκB活性以及上清中TNFα的含量。

1.4 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NFκB活性 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用生理鹽水將貼壁的CHO細(xì)胞清洗2次，加入裂解緩沖液反應(yīng)約15 min，向裂解產(chǎn)物中加入熒光素酶檢測(cè)試劑，嚴(yán)格按照熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，使用Glo-Max 96微孔板發(fā)光檢測(cè)儀評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)NFκB活性。

1.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNFα的含量移液槍移取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定上清液中TNFα的含量。

1.6 Western blot分析胞核中NFκB的含量 用細(xì)胞刮子將各組細(xì)胞刮下，嚴(yán)格按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書操作，提取胞核、胞漿蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書對(duì)蛋白進(jìn)行定量;蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)法印記于PVDF膜;用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗NFκB p65抗體4℃孵育過(guò)夜;次日用TBST洗滌后加入相應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h;洗滌后顯色。用Western blot印跡分析軟件(Gelpro3.2)計(jì)算各條帶光密度值，分析蛋白表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ±SE)表示。使用SPSS 13.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)參數(shù)或者非參數(shù)方差檢驗(yàn)，經(jīng)比較P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01認(rèn)為有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 LPS/HSP70/HMGB1/S100A4顯著上調(diào)細(xì)胞NFκB活性 各組細(xì)胞分別經(jīng)相應(yīng)的處理后，測(cè)定其NFκB的活性，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)NFκB的活性維持在較低的水平，經(jīng)LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激后，細(xì)胞內(nèi)NFκB活性顯著升高(P＜0.05，圖1)。但四種物質(zhì)激活NFκB活性的強(qiáng)度不盡相同，其中 LPS的激活作用最強(qiáng)，HSP70作用次之，HMGB1和S100A4對(duì)NFκB活性的刺激作用相當(dāng)。

2.2 LPS/HSP70/HMGB1/S100A4顯著增加胞外TNFα的含量 與對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)LPS/HSP70/ HMGB1/S100A4處理后，分泌到胞外的TNFα的量顯著增加(P＜0.05，圖2)。四種物質(zhì)中LPS刺激細(xì)胞分泌TNFα的作用最強(qiáng)，HMGB1作用最弱，HSP70和S100A4作用相當(dāng)。

圖2 LPS、HSP70、HMGB1、S100A4對(duì)細(xì)胞分泌TNFα的影響LPS/HSP70/HMGB1/S100A4顯著增加胞外TNFα的含量，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.3 LXA4/ProD1/RvD1下調(diào)細(xì)胞NFκB活性 與單純LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激的細(xì)胞相比，加入LXA4/ProD1/RvD1預(yù)處理的細(xì)胞，其NFκB的活性顯著被抑制(P＜0.05，圖3)，不同的物質(zhì)對(duì)NFκB活性的抑制程度存在差異，與對(duì)照組相比，LXA4抑制NFκB活化的作用最為顯著(P＜0.01)。

2.4 LXA4/ProD1/RvD1顯著減少胞外TNFα的含量 與單純LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激的細(xì)胞相比，加入LXA4/ProD1/RvD1預(yù)處理的細(xì)胞，分泌到胞外的TNFα的量顯著減少(P＜0.05，圖4)，但LXA4、ProD1或RvD1對(duì)TNFα分泌的抑制程度存在一定的差異。

2.5 LXA4/ProD1/RvD1減少NFκB的入核 與單純LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激的細(xì)胞相比，加入LXA4/ProD1/RvD1預(yù)處理的大部分組別細(xì)胞，其胞核內(nèi)NFκB p65的含量明顯降低(圖5)。但其中，ProD1、RvD1并不能抑制由HMGB1和S100引起的NFκB的入核。

圖3 LXA4、ProD1、RvD1顯著抑制NFκB活性A-LXA4處理組;B-ProD1處理組;C-RvD1處理組，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

圖4 LXA4、ProD1、RvD1顯著減少上清中TNFα含量A-LXA4處理組;B-ProD1處理組;C-RvD1處理組，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

圖5 LXA4/ProD1/RvD1對(duì)NFκB入核的影響A-LXA4處理組;B-ProD1處理組;C-RvD1處理組，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。HT?

3 討論

炎癥是機(jī)體抵抗病原入侵、修復(fù)組織細(xì)胞損傷的重要防御機(jī)制之一，若炎癥反應(yīng)持續(xù)維持在較高的水平會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，甚至導(dǎo)致組織的纖維化。炎癥的轉(zhuǎn)歸是指浸潤(rùn)在組織局部的白細(xì)胞及細(xì)胞碎片等被從炎癥部位清除，使組織重新恢復(fù)穩(wěn)態(tài)［8］。炎癥的轉(zhuǎn)歸并不是炎癥反應(yīng)的被動(dòng)終止，而是一個(gè)主動(dòng)的代謝過(guò)程［9，10］。一些脂質(zhì)小分子在炎癥的轉(zhuǎn)歸過(guò)程中具有重要的作用，脂氧素、保護(hù)素、Resolvin即是其中重要的一族，在機(jī)體內(nèi)，它們主要由ω-3不飽和脂肪酸在5-脂氧合酶、15-脂氧合酶等酶類的催化下經(jīng)過(guò)跨細(xì)胞途徑生成［11～13］。

NFκB是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，被NFκB激活的細(xì)胞因子，如IL-1β、TNFα可以直接進(jìn)一步引起NFκB的活化，從而形成一個(gè)正調(diào)控增加炎癥應(yīng)答和延長(zhǎng)慢性炎癥的持續(xù)時(shí)間［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用LXA4、ProD1、RvD1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，能夠不同程度抑制胞內(nèi)NFκB的活性，減少分泌到胞外的TNFα的量，其對(duì)NFκB活性的抑制作用與其抑制胞漿NFκB的入核有關(guān)，這可能是這幾個(gè)脂質(zhì)介質(zhì)具有促進(jìn)炎癥轉(zhuǎn)歸作用的重要原因之一。Wang等人在2011年的研究發(fā)現(xiàn)［15］，脂氧素同系物ATL能夠抑制胞漿IκB的降解，阻斷NFκB的入核，抑制NFκB、AP-1與DNA的結(jié)合，從而顯著抑制TNFα mRNA的表達(dá)，其抑制作用接近100%。本實(shí)驗(yàn)中，LXA4抑制由LPS、HSP70引起的NFκB活化的作用最為顯著，LXA4使細(xì)胞在LPS、HSP70刺激下的NFκB活性降低到接近正常細(xì)胞水平，因此推測(cè)LXA4對(duì)NFκB的激活具有強(qiáng)抑制作用的機(jī)制可能也與上述報(bào)道一致，這進(jìn)一步說(shuō)明LXA4等脂質(zhì)小分子具有被進(jìn)一步研究和開發(fā)的潛力。另外，本研究發(fā)現(xiàn)LXA4、ProD1、RvD1各自對(duì)細(xì)胞活化NFκB和產(chǎn)生TNFα的抑制作用強(qiáng)度存在較大差異，造成這種差異的內(nèi)在機(jī)制還有待更加深入的研究。

NFκB作為炎癥反應(yīng)中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，從理論上說(shuō)，如果能特異性地拮抗其活性，就可以起到高效的抗炎免疫效果。目前多種傳統(tǒng)抗炎藥，如糖皮質(zhì)激素、阿司匹林、水楊酸鈉等，就是通過(guò)多種途徑抑制NFκB等轉(zhuǎn)錄因子的活性，有效降低相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放。目前已有研究證明，LXA4、ProD1、RvD1具有抗炎和促炎癥轉(zhuǎn)歸的雙重作用［16］，雖然這3種脂質(zhì)介質(zhì)發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制和信號(hào)途徑還需要進(jìn)一步的深入研究，但是本實(shí)驗(yàn)為治療一些炎性疾病提供了新的思路，對(duì)于研究開發(fā)新型的小分子抗炎藥具有重要的參考價(jià)值。

［1］ Shames BD，Selzman CH，Meng XZ，et al.Genes don't count［J］.Arch Sung，1998，133(6):667.

［2］ Nemeth ZH，Hasko G，Vizi ES.Phrrolidine dithiocarbamate augments IL-10，inhibits TNF-alpha，MIP-1alpha，IL-12，and nitric oxide production and protects from the lethal effect of endotoxin［J］.Shock，1998，10(1):49.

［3］ Hamada N，Maeyama T，Kawaguchi T，et al.The role of high mobility group box l in pulmonary fibrosis［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2008，39:440.

［4］ Vabulas RM，Ahmad NP，Ghose S，et al.HSP70 as endogenous stimulus of the Toll/interleukin-1 receptor signal pathway［J］.J Biol Chem，2002，277:15107.

［5］ Foell D，F(xiàn)rosch M，Sorg C，et al.Phagocyte-specific calcinm-binding S100 proteins as clinical laboratory markers of inflammation［J］.Clin Chim Acta，2004，34:37.

［6］ Canny G，Levy O，F(xiàn)uruta GT，et al.Lipid mediator-induced expression of bactericidal/permeability-increasing protein(BPI)in human mucosal epithelia［C］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:3902.

［7］ Campbell EL，Louis NA，Tomassetti SE.et al.Resolvin E1 promotes mucosal surface clearance of neutrophils:a new paradigm for inflammatory resolution［J］.FASEB J，2007，21:3162.

［8］ Serhan，CN.A search for endogenous mechanisms of anti-inflammation uncovers novel chemical mediators:missing links to resolution［J］.Histochem Cell Biol，2004，122:305.

［9］ Bannenberg GL，Chiang N，Ariel A，et al.Molecular circuits of resolution:formation and actions of resolvins and protectins［J］.J Immunol，2005，174:4345.

［10］ Serhan CN，Brain SD，Buckley CD，et al.Resolution of inflammation:state of the art，definitions and terms［J］.FASEB J，2007，21:325.

［11］ Levy BD，Kohli P，Gotlinger K，et al.Protectin D1 is generated in asthma and dampens airway inflammation and hyperresponsiveness［J］.J Immunol，2007，178:496.

［12］ Duffield JS，Hong S，Vaidya VS，et al.Resolvin，series and protectin D1 mitigate acute kidney injury［J］.J Immunol，2006，177:5902.

［13］ Mitchell，S，Thomas G，Harvey K，et al.Lipoxins，aspirin-triggered epi-lipoxins，lipoxin stable analogues，and the resolution of inflammation:stimulation of macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils in vivo［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13:2497.

［14］ Oeckinghaus A，Ghosh S.The NF-kappaB family of transcription factors and its regulation［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1(4):1.

［15］ Wang YP，Wu Y，Li LY，et al.Aspirin-triggered lipoxin A4 attenuates LPS induced pro-inflammatory responses by inhibiting activation of NFκB and MAPKs in BV-2 microglial cells［J］.J Neuroinflammation.2011，8:95.

［16］ Serhan CN，Chiang N，Thomas E，et al.Resolving inflammation:dual anti-inflammatory and pro-resolution lipid mediators［J］?.Nat Rev Immunol，2008，8(5):349.