紫外分光光度法在制霉菌素油中制霉素含量測(cè)定中的應(yīng)用

李麗萍，張杜娟，崔秀君

(濟(jì)南市婦幼保健院，濟(jì)南250001)

制霉素為抗真菌類藥，能與真菌細(xì)胞膜上的特異甾醇結(jié)合，使細(xì)胞膜破壞，通透性改變，內(nèi)容物外漏而致細(xì)胞死亡，用于治療皮膚、黏膜等念珠菌感染［1］。制霉菌素油是本院自制外用制劑，由制霉素和甘油混合而成。本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定制霉素含量，用于制霉菌素油的質(zhì)量控制。

1 儀器與藥品

1.1 儀器 UV-2102PCS型紫外分光光度儀(上海龍尼柯儀器有限公司)，AL104電子天平(瑞士梅特勒—托利多)。

1.2 藥品 制霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)130344-201002，5 341 U/mg，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，制霉菌素油(魯藥制 ZBH0212，8.7 g/L，批號(hào) 20120808，20120814，20120817，濟(jì)南市婦幼保健院)，制霉素原料(批號(hào)110908，5 000 U/mg，浙江震元制藥有限公司)，甘油(批號(hào)20120118，湖南爾康制藥股份有限公司)，甲醇(分析純，批號(hào)T20061214，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 制霉菌素油樣品制備 取制霉素原料8.7 g，研細(xì)，加甘油適量，充分研勻，加甘油至1 000 mL即得。

2.2 溶液配制

2.1.1 儲(chǔ)備液配制 精密稱取制霉素標(biāo)準(zhǔn)品12 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混勻，得120 μg/mL制霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱儲(chǔ)存。

2.1.2 樣品溶液配制 取制霉菌素油樣品，搖勻，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇洗滌吸管內(nèi)壁3次，洗液并入量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻;精密量取稀釋液2 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得制霉菌素油樣品溶液。

2.3 波長(zhǎng)選擇 分別取制霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(12 μg/ mL)、制霉菌素油樣品溶液，以甲醇為基線，以甘油加甲醇稀釋為空白基質(zhì)，采用紫外分光光度法，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。紫外吸收?qǐng)D譜(圖1)顯示，空白基質(zhì)基本無(wú)吸收，制霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、制霉菌素油樣品溶液的紫外吸收光譜一致，有3個(gè)吸收峰，分別為290、304、318 nm，在304 nm波長(zhǎng)處吸光度最大，故選擇304 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 不同溶液的紫外吸收?qǐng)D譜注:A:甲醇(基線);B:空白基質(zhì);C:制霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(12 μg/mL);D:制霉菌素油樣品溶液

2.4 線性關(guān)系觀察 分別精密量取制霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，得7.2、9.6、12.0、14.4、16.8 μg/ mL制霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以甲醇為空白，在304 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以吸光度值對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，在濃度7.2～16.8 μg/mL范圍內(nèi)，回歸方程為吸光度 =0.009 80+0.047 25C，r= 0.999 6(n=5)，表明線性關(guān)系良好。

2.5 精密度 分別精密量取制霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋至高(14.4 μg/mL)、中(12.0 μg/ mL)、低(9.6 μg/mL)3個(gè)濃度，測(cè)定日內(nèi)精密度。連續(xù)測(cè)定3 d，測(cè)得日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1數(shù)據(jù)可知，制霉素測(cè)定方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性與中間精密度 ①重復(fù)性:精密量取同一批號(hào)的制霉菌素油6份，各1 mL，分別加甲醇稀釋定容至50 mL;取稀釋液2 mL，加甲醇稀釋至25 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量及RSD值。結(jié)果見(jiàn)表2。由表2數(shù)據(jù)可知，該方法重復(fù)性良好。②中間精密度:不同分析人員、不同日期分別精密量取同一批號(hào)的制霉菌素油6份，各1 mL，用甲醇稀釋(方法同重復(fù)性試驗(yàn))，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3數(shù)據(jù)可知，該方法中間精密度良好。

表1 制霉素含量測(cè)定日內(nèi)與日間精密度

2.7 加樣回收率 分別精密稱取制霉素標(biāo)準(zhǔn)品，加適量甘油，混勻，按處方比例分別配制高(120%)、中(100%)、低(80%)分別為6.96、8.70、10.44 mg/ mL的制霉菌素油樣品，每個(gè)濃度各3份。分別用甲醇稀釋625倍，分別得11.136、13.920、16.704 μg/ mL的制霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量及RSD值。結(jié)果見(jiàn)表4。由表4數(shù)據(jù)可知，該方法回收率在98%～102%，符合測(cè)定要求。

2.8 穩(wěn)定性 取制霉菌素油樣品溶液和制霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(12 μg/mL)各3份，分別于室溫避光放置2、4、8、12 h后，測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量，考察制霉素

表2 制霉素含量測(cè)定重復(fù)性

表3 制霉素含量測(cè)定中間精密度

表4 制霉素含量測(cè)定加樣回收率

室溫避光放置穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表5。由表5數(shù)據(jù)可知，制霉菌素油樣品溶液和制霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液室溫避光放置12 h穩(wěn)定。

表5 制霉素含量測(cè)定穩(wěn)定性

2.9 樣品測(cè)定 精密稱取制霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋，配制成12 μg/mL制霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取3個(gè)批次制霉菌素油樣品各1 mL，按2.1.2方法分別配制成制霉菌素油樣品溶液，每個(gè)批次各3份。以甲醇為空白，分別測(cè)定制霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液在304 nm波長(zhǎng)處的吸光度，用對(duì)照法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，制霉菌素油含量在90%～110%，符合要求。

3 討論

3.1 含量測(cè)定方法的選擇 制霉素中主要包括制霉菌素A1、A3和多真菌素B［2］。根據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-C2-0025-89，制霉素含量測(cè)定采用抗生素微生物檢定法，但該方法耗時(shí)、煩瑣、整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響因素多，且采用的啤酒酵母菌的抑菌圈邊緣清晰度不高，影響測(cè)定;劉興蘭等［3］等采用比濁法，該方法較管碟法簡(jiǎn)便，但影響因素較多;林艷等［4］采用高效液相色譜法測(cè)定制霉素的含量，用3個(gè)主峰的面積進(jìn)行定量，因制霉素包含多種組分，此方法不夠準(zhǔn)確;文獻(xiàn)多采用紫外分光光度法［5～10］測(cè)定制霉素的含量，該方法簡(jiǎn)便、快速和定量準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)也采用紫外分光光度法，經(jīng)驗(yàn)證，該法線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均符合要求，可用于制霉菌素油的質(zhì)量控制。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3.2 溶劑選擇 制霉素在甲醇中微溶，在水中極微溶解，在氯仿、乙醚中不溶，所以本實(shí)驗(yàn)采用甲醇作溶劑。

3.3 操作注意事項(xiàng) 制霉素具有引濕性，對(duì)光、空氣、酸或堿均不穩(wěn)定，制霉菌素油樣品在長(zhǎng)期放置后，顏色變深，所以本實(shí)驗(yàn)在操作過(guò)程中應(yīng)注意避光，并縮短操作時(shí)間。制霉菌素油黏稠度較大，在吸取樣品時(shí)，吸管內(nèi)壁易殘存樣品溶液，使取樣量誤差較大，須用甲醇洗滌，以降低誤差。

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