軟肝升白顆粒對(duì)硫代乙酰胺誘發(fā)大鼠肝硬化模型的影響

郭爭(zhēng)榮，劉金霞，程 志，候艷寧，李兵順，李敏然，孫殿興*

(1石家莊白求恩和平醫(yī)院，石家莊050082;2石家莊市人民醫(yī)院;3承德醫(yī)學(xué)院)

目前臨床上還缺乏確切有效的逆轉(zhuǎn)肝硬化藥物，研究者逐步發(fā)現(xiàn)許多傳統(tǒng)中草藥具有比較好的抗肝纖維化療效，以小柴胡湯、復(fù)方861合劑、復(fù)方鱉甲軟肝片、冬蟲(chóng)夏草、甘草、丹參、苦參等一大批具有活血化瘀、軟堅(jiān)散節(jié)功效的單方、復(fù)方中藥制劑為代表。中藥組方防治肝纖維化有比較光明的發(fā)展前景，它們以其多環(huán)節(jié)、多層次及多靶點(diǎn)的綜合作用，具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。2010年1月～2011年12月，為深入研究軟肝升白顆粒的療效和作用機(jī)制，通過(guò)建立硫代乙酰胺(TAA)誘導(dǎo)的大鼠肝硬化模型，采取不同時(shí)間和不同劑量分別觀察軟肝升白顆粒對(duì)肝纖維化大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、層黏連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)含量的影響及肝組織改變，為臨床尋找肝硬化治療方案開(kāi)辟新的治療途徑和方法［1］。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)Wistar大鼠100只，雄性，(180 ±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;TAA購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司、軟肝升白顆粒由白求恩國(guó)際和平醫(yī)院制劑科配制、復(fù)方鱉甲軟肝片由解放軍302醫(yī)院研制，內(nèi)蒙古集寧制藥廠(chǎng)饋贈(zèng)，生產(chǎn)批號(hào)20060609;HA、LN檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 肝纖維化模型的建立 肝硬化模型的制作應(yīng)用TAA誘導(dǎo)法，TAA用精確度為1/萬(wàn)的電子天平稱(chēng)取并用飲用水稀釋。用0.03%TAA誘導(dǎo)飼喂［1］，每1～2 d更換1次飲用水，確保藥物濃度的穩(wěn)定，誘導(dǎo)時(shí)間20周。

1.3 分組和給藥 80只大鼠造模成功后，隨機(jī)分為4組，每組20只，高劑量治療組(A組)大鼠給予軟肝升白顆粒8 g/(kg·d)灌胃，低劑量治療組(B組)大鼠給予軟肝升白顆粒4 g/(kg·d)灌胃，陽(yáng)性藥物對(duì)照組(C組)大鼠給予鱉甲軟肝片0.8 g/(kg ·d)灌胃，模型對(duì)照組(D組);另設(shè)20只大鼠為正常對(duì)照組(E組)。D組和E組分別給予等體積的生理鹽水灌胃。于造模結(jié)束后，停用TAA 1周，開(kāi)始給予上述藥物治療，1次/d，灌胃給藥［2］。

1.4 標(biāo)本留取和指標(biāo)檢測(cè) 分別在治療后第4周和8周處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，檢測(cè)肝功能及肝纖維化指標(biāo)，取部分肝組織，0.5 cm×0.5 cm×1 cm，10%甲醛固定，進(jìn)行HE染色和天狼猩紅特染。HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察，并進(jìn)行Knodell評(píng)分［3］。天狼猩紅染色用偏振光顯微鏡下觀察Ⅰ型膠原情況，每個(gè)標(biāo)本供觀察10個(gè)視野，并采用Photoshop軟件的Histogram功能分析統(tǒng)計(jì)各組織內(nèi)Ⅰ型膠原所占面積的百分?jǐn)?shù)，經(jīng)圖像分析。剩余肝組織－80℃凍存，備用。檢測(cè)肝組織內(nèi)羥脯氨酸的含量，采用胃酶酸解法［4］，根據(jù)測(cè)得的A560和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出每克肝組織的羥脯氨酸的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

2.1.1 HE染色 光鏡下正常組大鼠肝組織有完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞多為單核，肝板呈條索狀，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無(wú)變性、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生。D組大鼠停用TAA后4周時(shí)，肝組織可見(jiàn)大量肝細(xì)胞脂肪變性，呈空泡狀，胞質(zhì)著色亦深，偏嗜堿性。另有水樣變性甚至氣球樣變，部分細(xì)胞出現(xiàn)異型性，肝細(xì)胞核增大，著色深或雙核。近90%標(biāo)本可見(jiàn)散在的不同程度的壞死細(xì)胞，正常肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞;可見(jiàn)明顯的纖維組織增生，纖維間隔占整個(gè)視野2/3以上，增寬至2.5 mm以上，由匯管區(qū)、小葉間進(jìn)一步深入并分割肝小葉、假小葉形成。匯管區(qū)、肝竇及中央靜脈周?chē)梢?jiàn)多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn);停用TAA后8周時(shí)，肝細(xì)胞脂肪變性和肝組織纖維化程度有所恢復(fù)，但與其他各組不同時(shí)間的肝組織學(xué)變化仍有顯著性差異。A組可見(jiàn)肝纖維化明顯減輕，纖維間隔變細(xì)，肝細(xì)胞大小、形態(tài)接近正常，僅有少量空泡和氣球樣變，僅見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。B組和C組病理改變相似，肝組織內(nèi)可見(jiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，變性壞死以脂肪變?yōu)橹?，形成空泡，但纖維間隔變窄?？傊?，纖維組織增生、肝細(xì)胞變性及炎癥反應(yīng)較D組明顯減輕，但較A組抗纖維化效果差，見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖9。各組Knodell評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大鼠在治療4周和8周時(shí)肝組織Knodell評(píng)分(±s)

表1 大鼠在治療4周和8周時(shí)肝組織Knodell評(píng)分(±s)

注:與D組比較，*P＜0.05;與C組比較，#P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05

組別 4周 8周A組 11.0±1.2*#△ 7.3±1.4*#△315.46 220.65 B組 13.3±2.0* 9.5±1.0*# C組 14.9±1.4* 11.9±1.7* D組 24.8±2.3 19.1±2.3 E組 0* 0* F值

2.1.2 天狼猩紅染色 A組和B組與D組比較，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，肝臟膠原纖維增生亦明顯減輕，纖維條索變細(xì)變窄，肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)，匯管區(qū)和中央靜脈周?chē)z原顯著減少，見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖10，各組Ⅰ型膠原面積百分比見(jiàn)表2。

表2 大鼠在治療4周和8周時(shí)Ⅰ型膠原面積百分比(%，±s)

表2 大鼠在治療4周和8周時(shí)Ⅰ型膠原面積百分比(%，±s)

注:與D組比較，*P＜0.05;與C組比較，#P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05

組別 4周 8周A組 17.2±1.4*#△ 12.7±1.4*#△181.48 282.30 B組 21.0±2.1* 16.2±1.2* C組 21.3±2.4* 17.8±1.0* D組 29.9±4.0 27.3±2.8 E組 2.2±0.7* 1.9±0.3* F值

2.2 中藥對(duì)大鼠肝功能的影響 見(jiàn)表3。

表3 大鼠在治療4周和8周時(shí)血清ALT含量(U/L，±s)

表3 大鼠在治療4周和8周時(shí)血清ALT含量(U/L，±s)

注:與D組比較，*P＜0.05;與C組比較，#P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05

組別 4周 8周A組 103.5±10.8*#△ 84.2±8.4*#△234.01 533.82 B組 137.5±11.1* 96.5±9.0* C組 141.0±10.9* 94.2±7.7* D組 224.7±16.0 191.6±9.5 E組 25.7±5.8* 25.6±5.7* F值

2.3 血清HA、LN的變化 見(jiàn)表4。

表4 各組不同時(shí)間血清HA、LN值(ng/mL，±s)

表4 各組不同時(shí)間血清HA、LN值(ng/mL，±s)

注:與D組比較，*P＜0.05;與C組比較，#P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05

組別HA 4周 8周LN 4周 8周A組 737.1±35.4*#△ 482.3±47.7*#△ 518.9±29.6*#△229.3±32.5*#△B組 1 047.0±84.8* 721.4±33.9* 776.2±38.0* 306.4±22.3* C組 1 001.9±78.2* 729.2±73.0* 822.5±39.7* 502.3±25.1* D組 1 328.9±80.4 1 028.4±69.9 1 014.8±79.5 797.8±57.4 E組 117.1±9.7* 116.2±12.8* 108.7±9.5* 109.8±8.8* F值498.07 418.29 593.45 652.99

2.4 中藥對(duì)肝組織中羥脯氨酸羥的影響 見(jiàn)表5。

表5 各組不同時(shí)間肝組織內(nèi)羥脯氨酸含量(μg/g肝組織，±s)

表5 各組不同時(shí)間肝組織內(nèi)羥脯氨酸含量(μg/g肝組織，±s)

注:與D組比較，*P＜0.05;與C組比較，#P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05

組別 4周 8周A組 69.1±6.2*#△ 34.4±3.3*#△425.45 459.13 B組 95.4±7.1* 57.7±6.9* C組 100.3±7.8* 61.6±3.9* D組 143.6±10.7 112.5±8.2 E組 14.1±1.9* 14.1±2.7* F值

3 討論

肝硬化屬于中醫(yī)學(xué)“瘤”、“痹”、“痞”、“積”等范疇，痰瘀互結(jié)，致使全身氣、血、津液運(yùn)行不暢，陰陽(yáng)失調(diào)，最終形成肝硬化。軟肝升白顆粒由黃芪、丹參、當(dāng)歸、桃仁、白術(shù)、黨參、梔子、茵陳等16味中藥組成，具有活血軟堅(jiān)、化痰除濕功效。丹參，常用的活血化瘀中藥，在臨床以及實(shí)驗(yàn)研究中都被證實(shí)有較明確的抗肝硬化作用，抗肝硬化機(jī)制可能與其下調(diào)細(xì)胞因子、阻斷肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞(HSC)活化、減少膠原組織的合成及促進(jìn)自由基清除和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)［5］。黃芪具有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)固表等功效，可以明顯減少總膠原及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原在大鼠肝臟的病理性沉積，降低膠原蛋白含量，對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠具有明顯的治療作用［3，6］。體外實(shí)驗(yàn)表明，黃芪可明顯抑制體外激活的HSC增殖及膠原的產(chǎn)生［7］。臨床應(yīng)用黃芪注射液可以改善肝纖維化患者的肝功能，降低血清ALT、AST，提高ALB水平，使血清HA、LN下降;并能降低慢性肝炎患者血清TGF-β1、HA的水平，明顯改善肝纖維化程度［8］。桃仁散瘀結(jié)積聚，當(dāng)歸活血補(bǔ)血，對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損害和中毒性肝炎，有保護(hù)肝細(xì)胞和恢復(fù)肝功能的作用，并可防止肝糖原降低，對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞DNA、RNA的合成有促進(jìn)作用［9］。桃仁還有抗炎、抗過(guò)敏、利膽及抗肝纖維化的作用。茵陳對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷有保護(hù)作用，可減輕肝細(xì)胞腫脹、變性和壞死程度，改善臨床癥狀［10］。

本研究通過(guò)聯(lián)合上述藥物，從活血化瘀、抗炎和抗纖維化等方面配制軟肝升白顆粒，用于治療肝纖維化模型，與鱉甲軟肝片比較，從肝組織學(xué)和肝功能及纖維化指標(biāo)等多方面證實(shí)，具有很好的療效。

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