柱前衍生HPLC測(cè)定阿膠中17種水解氨基酸含量

謝 誼 ，易 艷 ，劉 陽(yáng) ，3，彭一波 ，3，王實(shí)強(qiáng) *

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)研究生班，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

柱前衍生HPLC測(cè)定阿膠中17種水解氨基酸含量

謝 誼1，易 艷2，劉 陽(yáng)1，3，彭一波1，3，王實(shí)強(qiáng)1*

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)研究生班，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 建立柱前衍生高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定阿膠中17種水解氨基酸含量的方法。方法 用6 mol/L鹽酸溶液水解阿膠中的氨基酸，以異硫氰酸苯酯為柱前衍生試劑；用Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30℃。結(jié)果 17種氨基酸在60 min內(nèi)均可得到很好的分離，回收率為97.4%～100.1%，RSD為1.6%～3.4%。結(jié)論 建立的方法可靠，可用于阿膠中17種水解氨基酸的含量測(cè)定。

阿膠；氨基酸；酸水解；柱前衍生高效液相色譜法

阿膠始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是馬科動(dòng)物驢或其他驢的皮去毛后熬制而成的膠塊[1]，有“補(bǔ)血圣藥”的美稱(chēng)。阿膠多由骨膠原組成，其水解可得明膠，蛋白質(zhì)和多種氨基酸，共含18種氨基酸[2]。大多數(shù)氨基酸不含芳香環(huán)等生色團(tuán)，不能直接用紫外法檢測(cè)，需將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外吸收或發(fā)熒光的衍生物進(jìn)行檢測(cè)。本文選用異硫氰酸苯酯[3-5]作為柱前衍生試劑，因其與一、二級(jí)氨基酸可同時(shí)反應(yīng)；衍生產(chǎn)物（苯氨基硫甲酰衍生物）單一、穩(wěn)定，衍生副產(chǎn)物對(duì)測(cè)定無(wú)干擾；采用常用的C18柱，用高效液相色譜法測(cè)定阿膠中17種水解氨基酸的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

島津LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，N2000數(shù)據(jù)工作站，KQ2200B型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)，AE240分析天平(METTLER)。

1.2 試藥

阿膠樣品(湖南長(zhǎng)沙、湖南株洲、河南)；L-谷氨酸對(duì)照品（140690-200401）、L-羥脯氨酸對(duì)照品（111578-200201）、甘氨酸對(duì)照品（110735-200102）、L-丙氨酸對(duì)照品（140680-200401）、L-精氨酸對(duì)照品（140685-200802）、L-脯氨酸對(duì)照品（140677-200405）均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用；其他11種氨基酸對(duì)照品均為生化試劑，大部分未標(biāo)明純度（L-天冬氨酸為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；L-組氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供）；乙腈為色譜純；異硫氰酸苯酯及其他試劑均為分析純。

圖1 17種氨基酸對(duì)照品（A）和阿膠供試品衍生物（B）的HPLC圖

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：HypersilBDSC18柱(200mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相：以乙腈-0.1 mol/L 乙酸鈉溶液（3∶97）為流動(dòng)相 A（用乙酸調(diào)節(jié) pH 6.5）、以乙腈-水（4∶1）為流動(dòng)相 B，按表 1進(jìn)行梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：30℃。

表1 梯度洗脫程序 （%）

在選定的色譜條件下測(cè)定17種氨基酸衍生物峰與其它相鄰峰分離度均大于1.5；按L-羥脯氨酸衍生物峰計(jì)算，理論板數(shù)在4 000以上。17種氨基酸對(duì)照品和供試品衍生物的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 6種氨基酸對(duì)照品貯備液的制備

分別精密稱(chēng)取6種氨基酸對(duì)照品，加0.1 mol/L鹽酸制成每1 mL分別含L-谷氨酸0.338 mg、L-羥脯氨酸 0.356 mg、 甘氨酸 0.762 mg、L-丙氨酸0.324 mg、L-精氨酸 0.236 mg、L-脯氨酸 0.506 mg的混合對(duì)照品貯備液。

2.3 17種氨基酸混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取L-天冬氨酸等17種氨基酸對(duì)照品于量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液配制成每1 mL分別含L-天冬氨酸43.2μg、L- 谷氨酸73.1μg、L- 羥脯氨酸86.4μg、L-絲氨酸 26.8μg、甘氨酸 160.9μg、L-組氨酸6.4μg、L-蘇氨酸 15.6μg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸 59.3μg、L-脯氨酸 93.9μg、L-酪氨酸 7.2μg、L-纈氨酸 21.2μg、L-甲硫氨酸12.4μg、L- 異亮氨酸12.8μg、L- 亮 氨 酸28.0μg、L-苯丙氨酸 15.6μg、L-賴(lài)氨酸 31.2μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備[6]將阿膠樣品研磨成粉后，取0.1 g于安瓿瓶中，精密稱(chēng)定，加6 mol/L鹽酸5 mL，置酒精噴燈上拉絲封口，超聲30 min使其溶解，150℃水解1 h，放冷，移入蒸發(fā)皿中，用10 mL水分次洗滌安瓿瓶，洗液并入蒸發(fā)皿，水浴蒸干。殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 異硫氰酸苯酯衍生化物的制備 取上述17種氨基酸混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 mL，分別置10 mL離心管中，加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液1.0 mL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液1.0 mL，漩渦混合1 min，放置1 h后，加入4 mL正已烷，漩渦混合1 min后，放置10 min，取下層溶液，濾過(guò)，即得。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取L-谷氨酸等6種混合氨基酸對(duì)照品貯備液 1、2、3、4、5、6 mL， 分別置于 10 mL 量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸加至刻度，搖勻。按“2.3.3”項(xiàng)下衍生化處理后，分別吸取上述溶液5 μL注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積積分值，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值（mv）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得6種氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L-谷氨酸等6種氨基酸的線(xiàn)性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗(yàn)

取阿膠（長(zhǎng)沙1批）依“2.3”法制備供試品溶液，每次進(jìn)樣5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定L-谷氨酸、L-羥脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的峰面積積分值，結(jié)果RSD分別為1.7%、1.9%、1.9%、1.4%、1.8%及1.7%，表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取阿膠（長(zhǎng)沙1批）依“2.3”法制備供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣 5 μL， 測(cè)定 L-谷氨酸、L-羥脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的峰面積，結(jié)果RSD分別為1.5%、1.8%、1.5%、0.9%、1.4%及1.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取阿膠（長(zhǎng)沙1批）依“2.3”法制備供試品溶液共6份，測(cè)定樣品中L-谷氨酸、L-羥脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸含量，RSD分別為1.6%、1.5%、1.7%、1.8%、1.7%及1.6%，表明本方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取阿膠（長(zhǎng)沙1批）適量，研細(xì)，取約0.05 g，共6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入適量的L-谷氨酸、L-羥脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)衍生化后測(cè)定各氨基酸的含量，計(jì)算回收率。得L-谷氨酸、L-羥脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的回收率（RSD）分別為 97.7%（3.4%）、99.3%（3.3%）、100.1%（2.8%）、97.4%（2.7%）、97.5%（3.2%）及 99.3%（1.6%）。結(jié)果表明6種氨基酸回收率較好。

2.9 樣品測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下方法制備各阿膠樣品的供試品溶液，按“2.1”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，用峰面積按外標(biāo)法定量計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 10批阿膠樣品17種氨基酸含量測(cè)定結(jié)果 （n=2，%）

3 討論

流動(dòng)相的選擇中，參考了2010版《中國(guó)藥典》一部阿膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的流動(dòng)相系統(tǒng)，但梯度的設(shè)計(jì)比《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)更精密，使17種氨基酸得到很好的分離，藥典標(biāo)準(zhǔn)中只測(cè)定了其中4種氨基酸的含量，本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果基本可靠，能更全面反映阿膠中水解氨基酸的組成及含量，可作為阿膠質(zhì)量控制的依據(jù)。

阿膠水解氨基酸的制備中，考察了130℃水解5 h和150℃水解1 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者所測(cè)得的氨基酸含量差別不大，說(shuō)明都已經(jīng)水解完全，所以選用150℃水解1 h。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)10批阿膠的水解氨基酸組成及含量進(jìn)行了分析，雖然文獻(xiàn)報(bào)道阿膠含有18種氨基酸，但在實(shí)際檢測(cè)中，未檢測(cè)出胱氨酸，故共測(cè)定了其中的17種氨基酸含量且總含量大于80%（82.4%～96.8%）。由于對(duì)照品的原因，只做了中檢所提供的6種氨基酸的線(xiàn)性關(guān)系考察和回收率試驗(yàn)，結(jié)果可靠，其他11種氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果也具參考價(jià)值。

[1]宋立人，洪 恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001∶1 118

[2]陳定一，王靜竹，劉文林.阿膠及其炮制品中氨基酸和微量元素的分析研究［J］.中國(guó)中藥雜志，1991，16（2）：833-835.

[3]宋志峰，王 麗，紀(jì) 鋒，等.氨基酸分析中的柱前衍生技術(shù)［J］.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，29（6）：54-58.

[4]胡建鴻，邱 利，王成潤(rùn)，等.柱前衍生反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定保健飲品中16種氨基酸［J］.食品科技，2008(10):211-214.

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（本文編輯 楊 瑛）

Determination of 17 kinds of hydrolyzed amino acids content in donkey-hide glue by HPLC with pre-column derivatization

XIE Yi,YI Yang,LIU Yang,PENG Yi-bo,WANG Shi-qiang
(Institute of Chinese Materia Medica,TCM Academy of Hunan,Changsha,Hunan 410013,China)

Objective To determine the contents of 17 kinds of hydrolyzed amino acids in donkey-hide glue by HPLC with pre-column derivatization at the same time.Methods To extract amino acids by the method of hydrolysis in 6 mol/L HCl and use phenylisothiocyanate(PITC)as the derivating agent.The Hypersil BDS C18column(200 mm×4.6 mm,5 μm)was used.Under the condition of gradient elution,the flow rate was 1.0 mL/min,the UV detection wavelength was 254 nm,and the column temperature was 30℃.Results 17 kinds of amino acids can be separated well in 60 min.The average recoveries were 97.4%～100.1%and RSD were 1.6%～3.4%.Conclusion The method is reliable for the determination of 17 kinds of amino acids in donkey-hide glue.

donkey-hide glue;17 kinds of amino acids;acid hydrolysis;HPLC with pre-column derivatization

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.05.011.046.04

2011-10-19

謝 誼（1974-），女，白族，湖南懷化人，助理研究員，碩士，主要從事中藥制劑分析工作。

* 王實(shí)強(qiáng)，男，研究員，E-mail：wsq8135@163.com。