HPLC測定補(bǔ)陽還五湯總苷中黃芪甲苷和芍藥苷的含量

鄒 龍，劉 輝，李仲秋，鄧常清*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

HPLC測定補(bǔ)陽還五湯總苷中黃芪甲苷和芍藥苷的含量

鄒 龍，劉 輝，李仲秋，鄧常清*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的 建立高效液相色譜法測定補(bǔ)陽還五湯總苷中黃芪甲苷和芍藥苷的含量。方法 色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），黃芪甲苷測定：蒸發(fā)光散射檢測器，流動(dòng)相為甲醇∶水=80∶20（v/v）；漂移管溫度 60 ℃；氣體流量 1.5 L/min；輸出壓力 0.5 MPa；柱溫 30 ℃。 芍藥苷測定：流動(dòng)相為甲醇∶水=23∶77（v/v）；流速為 1 mL/min，檢測波長：218 nm， 柱溫：30℃。 結(jié)果 黃芪甲苷在0.57～9.10μg時(shí)，Y=1.506 3X+2.409 6，r=0.999 4； 芍藥苷在0.48～7.70μg時(shí)，Y=598.91X-2.334 6，r=0.999 9；其線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99.62%和101.1%，RSD為2.6%和1.7%(n=6)。結(jié)論 本法快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于黃芪甲苷及芍藥苷的含量測定，并為其總苷物質(zhì)制備工藝研究提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

補(bǔ)陽還五湯；高效液相色譜法；黃芪甲苷；芍藥苷；含量測定；黃芪；赤芍；地龍

補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》[1]，由黃芪、赤芍、當(dāng)歸、地龍、川芎、桃仁、紅花組成。其方中苷類物質(zhì)是補(bǔ)陽還五湯中重要的活性成分[2]，本文對(duì)其原方藥材進(jìn)行提取，醇沉，通過732陽離子樹脂，氯仿萃取及DA-201大孔樹脂洗脫后得到的總苷類物質(zhì)，采用高效液相色譜法（HPLC）[3-7]對(duì)其中黃芪甲苷和芍藥苷進(jìn)行含量測定，為該方總苷類工藝研究提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。本文建立的方法與吳青業(yè)[8]，何石蘭等[9]所采用的乙腈-酸水系統(tǒng)檢測比較，甲醇-純水系統(tǒng)具有方便簡單，毒性小，易操作等特點(diǎn)。

1 儀器與試藥

Agilent-1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；蒸發(fā)光散射檢測器Allteeh El803300（埃文森科技有限公司）；Ohaus-AR124CN型電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。黃芪甲苷對(duì)照品（上海源葉科技有限公司，批號(hào) YY20100809，HPLC≥98%）；芍藥苷對(duì)照品（上海源葉科技有限公司，批號(hào)YY20100505，HPLC≥98%）；補(bǔ)陽還五湯總苷物質(zhì)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào) 20110428、20110625、20110717。

總苷類物質(zhì)樣品由補(bǔ)陽還五湯全方經(jīng)過兩次水提，每次1 h，合并煎液經(jīng)真空濃縮后，85%乙醇醇沉3次，每次靜置12 h，濾過，回收乙醇，樣品液通過預(yù)先處理好的732陽離子樹脂，收集水洗液經(jīng)氯仿萃取，分離水層通過預(yù)處理好的DA-201大孔樹脂，60%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮后真空干燥，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；黃芪甲苷檢測條件：流動(dòng)相為甲醇∶水=80∶20（v/v）；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；漂移管溫度60℃；氣體流量1.5 L/min；輸出壓力0.5 MPa；柱溫30℃；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。芍藥苷檢測條件：檢測波長為218 nm；流動(dòng)相為甲醇∶水=23∶77（v/v）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。進(jìn)樣量均為10 μL。

2.2 對(duì)照品及供試品溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液 取黃芪甲苷對(duì)照品9.1 mg，加甲醇定容至10 mL，制得含黃芪甲苷0.91 mg/mL的對(duì)照品溶液。

取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對(duì)照品7.7 mg，用甲醇定容至10 mL，制得含芍藥苷0.77 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取總苷類樣品0.051 g精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL乙醇，浸泡 4 h，超聲處理 20 min，放冷，濾過，置60℃水浴揮掉溶劑后補(bǔ)加甲醇定容至10 mL，0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.3 樣品含量測定的方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍 （1）取黃芪甲苷對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液 （0.91 mg/mL）， 分別加甲醇配成 0.91、0.455、0.227 5、0.113 6、0.056 9 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液，依法測定，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程：Y=1.506 3X+2.409 6，r=0.999 4。結(jié)果表明黃芪甲苷在0.57～9.10μg 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。（2）取芍藥苷對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液（0.77 mg/mL），分別加甲醇配制成 0.77、0.385、0.192 5、0.096 2、0.048 1 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液，依法測定，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程：Y=598.91X-2.334 6，r=0.999 9。結(jié)果表明芍藥苷在0.48～7.70μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 陰性干擾實(shí)驗(yàn) 原方分別去除黃芪、赤芍，按照制備工藝分別制備為缺黃芪甲苷和缺赤芍的陰性對(duì)照。按“2.2.2”項(xiàng)下進(jìn)行樣品的配制并測定，陰性樣品色譜在黃芪甲苷和芍藥苷相應(yīng)的保留時(shí)間上無干擾峰（補(bǔ)陽還五湯總苷、黃芪甲苷、芍藥苷對(duì)照品及其陰性液相色譜圖分別見圖1～6）。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取濃度為0.168 mg/mL的黃芪甲苷和濃度為0.192 5 mg/mL的芍藥苷對(duì)照品溶液10 μL，分別重復(fù)進(jìn)樣5次，測得黃芪甲苷其峰面積積分值 551.7、567.8、555.5、564.3、557.8。芍藥苷峰面積值分別為 1 136.9、1 165.8、1 175.2、1 180.7、1 175.35，RSD 分 別 為1.17%和1.5%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取供試品溶液 （批號(hào)20110625）于 0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣 10 μL，黃芪甲苷峰面積分別為：693.1、692.3、707、700.1、698.5， 芍藥苷峰 面 積 值 分 別 為 ：3 090.83、3 134.99、3 155.78、3 165.7、3 194.5，RSD 分 別 為 0.85% 和1.23%，結(jié)果表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品的HPLC圖

圖2 補(bǔ)陽還五湯總苷樣品的HPLC圖

圖3 黃芪甲苷陰性對(duì)照液的HPLC圖

圖4 芍藥苷對(duì)照品的HPLC圖

圖5 補(bǔ)陽還五湯總苷樣品的HPLC圖

圖6 芍藥苷陰性對(duì)照液的HPLC圖

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取5份補(bǔ)陽還五湯總苷 51 mg(批號(hào) 20110625)，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制并測定，進(jìn)樣10 μL，測得黃芪甲苷峰面積分別為 701.1、693.1、713、697.6、704.8。芍藥苷峰面積值分別為 3 122.75、3 166.87、3 148.6、3 178.52、3 116.8，RSD 分別為 1.1%和 0.85%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的總苷樣品適量（批號(hào)20110625，黃芪甲苷含量為37.8 mg/g，芍藥苷含量為103.93 mg/g）3.7 mg共6份，5 mg 6份。前者6份分別精密加入1 mL黃芪甲苷對(duì)照品（0.14 mg/mL），后者6份分別精密加入1 mL芍藥苷對(duì)照品（0.481 3 mg/mL）然后按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法配制并測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表 1～2。

表1 芍藥苷回收率結(jié)果 （mg，%）

表2 黃芪甲苷回收率結(jié)果 （mg，%）

2.3.7 樣品含量測定 分別精密稱取3批樣品0.051 g（批號(hào) 20110428、20110625、20110717），按照“2.2.2”項(xiàng)下進(jìn)行樣品溶液的配制并測定，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖并計(jì)算：黃芪甲苷含量依次為38.45、37.81、38.24 mg/g，平均含量為（38.17 ±0.33)mg/g。 芍藥苷的含量依次為 103.60、103.93、102.92 mg/g，平均含量為(103.48±0.52)mg/g。

3 討論

本文建立了測定補(bǔ)陽還五湯總苷中黃芪甲苷和芍藥苷的HPLC。在制備總苷物質(zhì)的過程中，先后考察了多種提取手段對(duì)本品的提取效果。反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，采用全方經(jīng)過兩次水提，每次1 h，合并煎液經(jīng)濃縮后，85%乙醇3次醇沉，回收乙醇，樣品液通過732陽離子樹脂，氯仿萃取及DA-201大孔樹脂洗脫所得到的樣品總苷類物質(zhì)能得到較好結(jié)果。含量測定結(jié)果表明，采用C18柱，黃芪甲苷采用蒸發(fā)光散射檢測器，流動(dòng)相為甲醇∶水=80∶20（v/v）；芍藥苷采用甲醇∶水=23∶77（V/V），檢測波長 218 nm。 采用本法操作簡單、線性范圍寬、回收率高、重復(fù)性良好，是一種簡便有效檢測補(bǔ)陽還五湯總苷中黃芪甲苷和芍藥苷含量的方法。

本文測得結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯總苷類物質(zhì)中黃芪甲苷含量(38.17±0.33)mg/g、芍藥苷含量(103.48±0.52)mg/g，比原方中未經(jīng)陽離子樹脂、氯仿及DA-201處理過的黃芪甲苷含量 （0.127±0.004）mg/g、芍藥苷（1.33±0.03）mg/g 含量有很大提高，所建立的方法為該方總苷制劑的工藝研究提供了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

[1]清·王清任.醫(yī)林改錯(cuò)[M].上海:上?？萍汲霭嫔?，1966：31.

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[3]李小安，張 軍，科亞蘭，等.HPLC-ELSD法測定暖胃舒膠囊中黃芪甲苷的含量[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2007，27(2):67-68.

[4]蕭 偉，彭國平，文紅梅.HPLC法測定醒腦通絡(luò)粉針中苦杏仁苷與芍藥苷的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(2):102-103.

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（本文編輯 楊 瑛）

Determination of Astragaloside IV and paeoniflorin in total glucosides of Buyang Huanwu decoction by HPLC

ZOU Long， LIU Hui， LI Zhong-qiu， DENG Chang-qing
(TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410208， China)

Objective To establish the HPLC conditions for determination of Astragaloside IV and paeoniflorin in totalglucosides ofBuyang Huanwu decoction.Methods The Kromasil C18 column(250 mm×4.6 mm,5μm)was used. Astragaloside IV detection conditions：Evaporative light scattering detector was used；the mobile phase was methanol-water(80：20)(v/v)；temperature of drift tube was 60 ℃；gas flow rate was 1.5 L/min；pressure was 0.5 Mpa and column temperature was 30 ℃.Paeoniflorin detection conditions：the mobile phase was methanol-water（23：77）（v/v）；the flow rate was 1.0 mL/min；the detection wavelength was 218 nm and column temperature was 30 ℃.Results Astragaloside IV was better in linear correlation between 0.57～9.10μg,Y=1.5063X+2.4096， (r=0.9994).Paeoniflorin was better in linear correlation between 0.48 ～7.70μg,Y=598.91X-2.3346(r=0.9999).The average recoveries were 99.62%and 101.3%respectively，and RSD were 2.6%and 1.7%(n=6)respectively.Conclusion The method is rapid,simple and accurate and has high sensitivity for determination of Astragaloside IV and paeoniflorin,which can provide quality standards for the study of total glycosides.

Buyang Huanwu Decoction； HPLC； Astragaloside IV； Paeoniflorin；content determination;Radix Astragali;Paeoniae Radix Rubra;Pheretima

*鄧常清，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：dchangq@sohu.com。

R284.1

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.05.009.039.04

2012-02-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81072750）。

鄒 龍（1969-），男，湖南新化人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥制劑工藝與質(zhì)量控制研究工作。