黃連解毒湯體外抗菌活性研究

曾雪花 周桂保 楊湘江 廖劍新

1.廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東深圳 518116；2.廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東東莞 523000

黃連解毒湯首載于晉·葛洪《肘后備急方》，但未出方名；唐·王燾《外臺(tái)秘要》引崔氏方，始冠名為黃連解毒湯，是由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味中藥按 3∶2∶2∶3 比例配伍組成的清熱解毒方劑，具有清熱、瀉火、解毒之功效，主要治療實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證。黃連解毒湯方劑中以黃連瀉心火、兼瀉中焦之火為君，黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣，黃柏瀉下焦之火、梔子通瀉三焦之火合為佐使[1]。其中，黃連、黃芩、黃柏及梔子都有不同程度的抗菌作用。本文旨在研究黃連解毒湯在體外對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性，為其臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；凈化工作臺(tái)（蚌埠凈化設(shè)備廠）；DHG-9125A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海柏欣儀器設(shè)備廠）；G154DW自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（致微儀器有限公司）；AND GH-202電子天平 （日本A&D公司）；麥?zhǔn)媳葷峁埽ū本┨彀猜?lián)合科技有限公司）。

1.2 試藥

中藥飲片黃連、黃芩、黃柏及梔子（深圳一致藥業(yè)股份有限公司藥材加工廠）；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、福氏志賀菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌及傷寒沙門(mén)菌（深圳市龍崗中心醫(yī)院微生物室提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃連解毒湯的制備[2]

分別稱取中藥飲片黃連、黃芩、黃柏和梔子 9、6、6、9 g（質(zhì)量比為 3∶2∶2∶3）混合，加 10 倍量的純化水浸泡 30 min，煎煮60 min，8層紗布濾過(guò)，藥渣再加5倍純化水煎煮60 min，8層紗布濾過(guò)，將兩次煎煮濾液合并、離心后濃縮為10 mL，即每1 mL濃縮液相當(dāng)于原生藥3 g。將濃縮液作為黃連解毒湯儲(chǔ)備液置100℃，20 min飽和蒸汽高壓滅菌后，4℃條件下保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)，用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至適宜濃度。

2.2 供試菌液的制備[3-4]

將傳代純化的實(shí)驗(yàn)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h，菌液用3 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯校正濃度至0.5 cfu，作為供試菌液。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定及結(jié)果

采用連續(xù)倍比試管稀釋法，取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按照說(shuō)明書(shū)配制好后，分裝于8根試管中并編號(hào)，1號(hào)試管加入4 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，2～8號(hào)試管每管均加3 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于121℃，15 min高壓滅菌后備用。吸取黃連解毒湯2 mL加入1號(hào)試管中充分搖勻，濃度為1 000 mg/L，從1號(hào)試管內(nèi)吸取3 mL藥液置2號(hào)試管中，充分混勻，3～6號(hào)試管采用該法依次倍比稀釋 1/4、1/8、1/16、1/32，使 1～6 號(hào)試管藥液濃度依次為 1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.25 mg/L；然后每根試管加入0.3 mL供試菌液。同時(shí)，7號(hào)試管加入0.3 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，8號(hào)試管加入0.3 mL供試菌液作為陽(yáng)性對(duì)照組。將1～8號(hào)試管充分搖勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察各試管培養(yǎng)液的混濁情況，以未出現(xiàn)混濁即未見(jiàn)供試菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為黃連解毒湯對(duì)該菌株的MIC。結(jié)果顯示，黃連解毒湯在體外對(duì)副溶血弧菌的MIC為62.5 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為125.0 mg/mL；對(duì)福氏志賀菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌及傷寒沙門(mén)菌的MIC均＞1 000 mg/mL；空白對(duì)照組均未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)渾濁，陽(yáng)性對(duì)照組均可見(jiàn)渾濁。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度黃連解毒湯對(duì)供試菌抑菌作用測(cè)定結(jié)果（mg/mL）

2.4 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定及結(jié)果

取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按照說(shuō)明書(shū)制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基若干，于121℃，15 min高壓滅菌后，吸取MIC終點(diǎn)濃度以上未見(jiàn)生長(zhǎng)細(xì)菌培養(yǎng)液0.1 mL加至0.9 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，混勻使藥液濃度稀釋為原來(lái)的1/10，然后吸取0.1 mL稀釋液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)置加0.1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液組作為空白對(duì)照組，加0.1 mL供試菌液組作為陽(yáng)性對(duì)照組，均置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察平板培養(yǎng)基有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為黃連解毒湯的MBC。結(jié)果表明，黃連解毒湯在體外對(duì)副溶血弧菌的MBC為125.0 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC為125.0 mg/mL；空白對(duì)照組均未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照組均可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。具體見(jiàn)表2。

表2 黃連解毒湯對(duì)供試菌的MIC、MBC測(cè)定結(jié)果（mg/mL）

3 討論

黃連解毒湯是中醫(yī)清熱解毒方中的經(jīng)典方劑，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[5-10]，黃連解毒湯具有多種藥理活性，如抗氧化，抗腫瘤，抗血栓，調(diào)節(jié)血糖，抗炎作用及抗菌作用等。本研究旨在初步了解黃連解毒湯的抗菌譜，并進(jìn)一步探討其對(duì)敏感菌的抗菌活性大小。

本研究按照黃連解毒湯的傳統(tǒng)煎煮方法，考慮煎煮時(shí)間的影響[2]，將煎煮時(shí)間規(guī)定為60 min。研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯對(duì)金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌體外較敏感，MIC分別為125.0、62.5 mg/mL，MBC 均為 125.0 mg/mL；對(duì)福氏志賀菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌及傷寒沙門(mén)菌的抑菌作用不明顯，MIC均＞1 000 mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，黃連解毒湯對(duì)細(xì)菌的抗菌作用具有一定的選擇性，對(duì)金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌的抗菌活性明顯強(qiáng)于福氏志賀菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌及傷寒沙門(mén)菌。

黃連解毒湯成分研究表明[11-14]，黃連解毒湯主要含有生物堿、黃酮及環(huán)烯醚萜苷三大類成分。其中，生物堿主要為小檗堿、巴馬亭、藥根堿；黃酮類主要有黃芩苷、漢黃芩素及木犀草素等；環(huán)烯醚萜類主要為梔子苷。小檗堿作為黃連解毒湯的主要有效成分，具有抗菌、調(diào)節(jié)血脂血糖等多種藥理作用，特別是因?yàn)槠鋸V譜抗菌活性，已被臨床應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等所致的胃腸道感染的治療[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯的抗菌活性具有一定選擇性，與小檗堿的抗菌譜存在一定差異。提示，中藥湯劑成分復(fù)雜，很難用一種成分解釋某種藥理活性；同時(shí)，黃連解毒湯還可能存在其他抗菌活性的化學(xué)成分有待進(jìn)一步研究。

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