免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測羥基喜樹堿對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的TIMP-3及空泡化作用

蒲錦蘭 周 瀅

1.四川省劍閣縣人民醫(yī)院藥劑科，四川劍閣 628300；2重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016

免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測羥基喜樹堿對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的TIMP-3及空泡化作用

蒲錦蘭1周 瀅2▲

1.四川省劍閣縣人民醫(yī)院藥劑科，四川劍閣 628300；2重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016

目的探索羥基喜樹堿對乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因TIMP-3表達(dá)，觀察羥基喜樹堿處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞形態(tài)的改變，從而探討羥基喜樹堿在乳腺癌治療中的潛在新靶點(diǎn)。 方法 以乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究模型，細(xì)胞暴露于羥基喜樹堿濃度為10、40、80mg/L的培養(yǎng)液中24h，PBS組為對照組。采用免疫組化法檢測羥基喜樹堿（HCPT）對乳腺癌MCF-7細(xì)胞TIMP-3表達(dá)特征及細(xì)胞形態(tài)的變化。 結(jié)果 HCPT對TIMP-3誘導(dǎo)表達(dá)作用差異不明顯，但HCPT處理組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的空泡化。 結(jié)論HCPT可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞空泡化作用。

羥基喜樹堿；空泡化；免疫細(xì)胞化學(xué)法；金屬蛋白酶組織抑制劑-3

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%。它的發(fā)病常與遺傳有關(guān)，以及40～60歲、絕經(jīng)期前后的婦女發(fā)病率較高。迄今為止，乳腺癌的病因及其惡性進(jìn)展的具體機(jī)制尚未完全闡明，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，從基因角度尋找乳腺癌治療中的潛在新靶點(diǎn)對改善患者病情具有非常重要的意義。

羥基喜樹堿（hydroxycamptothecin，HCPT）是所有天然喜樹堿同類物或合成喜樹堿中活性最大的天然衍生物，是一種純天然的抗癌藥物[1]，其可通過激活NF-κB誘導(dǎo)人促進(jìn)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞凋亡[2]，亦可依賴Caspase3途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。Liu W等[4]發(fā)現(xiàn)HCPT可促進(jìn)p21WAF1/CIP1表達(dá)上調(diào)，并通過p53依賴/非依賴途徑誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，達(dá)到殺傷癌細(xì)胞的目的。TIMP-3則作為MMP的抑制劑之一[5]，故其TIMP-3表達(dá)上調(diào)有利于抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[6]。然而，迄今有關(guān)羥基喜樹堿與人乳癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究和探討。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測羥基喜樹堿對乳腺癌乳腺癌MCF-7細(xì)胞的影響，探討羥基喜樹堿在乳腺癌治療中的潛在新靶點(diǎn)，以期為臨床治療乳腺癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，購自重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院。HCPT注射液購自吉林省長春天誠藥業(yè)有限公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Hepes、二甲基亞砜（DMSO）均購于Gibco公司。Transwell小室購自CORNING公司，Matrigel膠購于BD Biosciences公司，引物由上海生工有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的藥物處理 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院提供。MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%新生胎牛血清，20mmol/L Hepes，2.0g/L碳酸氫鈉，100U/mL青霉素和 100U/mL鏈霉素），置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d傳代1次。PBS空白對照組加入20μL PBS緩沖液，HCPT誘導(dǎo)組施加TCPT，使其終濃度分別為10、40、80mg/L細(xì)胞培養(yǎng)液，顯微鏡下顯色為陰性者陰性對照組。

1.2.2細(xì)胞組化檢測TIMP-3在細(xì)胞中的表達(dá) 取MCF-7細(xì)胞經(jīng)消化離心后以5×107個(gè)/L的密度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁、基本長滿蓋玻片后，更換無血清培養(yǎng)基饑餓24h，24h后分別向各孔中施加TCPT，使其終濃度分別為10、40、80mg/L，24h后吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，取出細(xì)胞爬片，0.01mol/L PBS沖洗3次，每次3min，用4g/L多聚甲醛固定，每一濃度組制備16張標(biāo)本。對細(xì)胞爬片進(jìn)行TIMP-3免疫組化SP法染色，染色結(jié)果在顯微鏡下觀察并攝影。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，mRNA相對表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫細(xì)胞組化結(jié)果顯示，TIMP-3在MCF-7細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，僅從表觀上看，HCPT對其誘導(dǎo)表達(dá)作用差異不明顯，但HCPT處理組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的空泡化，見圖1。

3 討論

近年來有研究表明，HCPT及其衍生物可通過作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ來抑制DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和有絲分裂，達(dá)到抗腫瘤作用。HCPT衍生物7-乙基羥基喜樹堿可以募集S期細(xì)胞，促進(jìn)吉西他濱（抗腫瘤藥物）代謝物的聚集，減少關(guān)卡蛋白激酶1的合成，即7-乙基羥基喜樹堿有助于腫瘤細(xì)胞敏化，促進(jìn)其他化療藥物的效應(yīng)[7]。HCPT的抑癌機(jī)制的研究深入將有助于進(jìn)一步對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和臨床應(yīng)用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，HCPT對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞的增殖起抑制作用?；虮磉_(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)，HCPT誘導(dǎo)后，共獲得了差異表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因55個(gè)，涉及6個(gè)信號(hào)通路[8]。

本實(shí)驗(yàn)利用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測了羥基喜樹堿（HCPT）對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的空泡化作用。HCPT對TIMP-3誘導(dǎo)表達(dá)作用差異不明顯，但HCPT處理組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的空泡化，因此，HCPT可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞空泡化作用，希望本研究對尋找羥基喜樹堿在乳腺癌治療中的潛在新靶點(diǎn)有所幫助，并為臨床治療乳腺癌提供新思路。

[1]Ling YH，Tseng MT，Nelson JA.Differentiation induction of human promyelocytic leukemia cells by 10-hydroxycamptothecin，a DNA topoisomerase I inhibitor[J].Differentiation，1991，46（2）：135-141.

[2]葉孟，林蕾，方勇等.Bay117802抑制羥基喜樹堿誘導(dǎo)的人乳腺癌Bcap37細(xì)胞凋亡[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，7：755-759.

[3]葉孟，林蕾，方勇.羥基喜樹堿依賴Caspase3途徑誘導(dǎo)人乳腺癌Bcap37細(xì)胞凋亡[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（8）：881-883.

[4]Liu W，Zhang R.Upregulation of p21WAF1/CIP1in human breast cancer cell lines MCF-7and MDA-MB-468undergoing apoptosis induced by natural product anticancer drugs 10-hydroxycamptothecin and camptothecin through p53-dependent and independent pathways[J].Int J Oncol，1998，12（4）：793-804.

[5]Uría JA，F(xiàn)errando AA，Velasco G，et al.Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3，a new member of the metalloproteinase inhibitor family.Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3，a new member of the metalloproteinase inhibitor family[J].Cancer Res，1994，54（8）：2091-2094.

[6]Finan KM，Hodge G，Reynolds AM，et al.In vitro susceptibility to the pro-apoptotic effects of TIMP-3gene delivery translates to greater in vivo efficacy versus gene delivery for TIMPs-1or-2[J].Lung Cancer，2006，53（3）：273-284.

[7]Gálvez-Peralta M，Dai NT，Loegering DA，et al.Overcoming S-phase checkpoint-mediated resistance：sequence-dependent synergy of gemcitabine and 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin （SN-38） in human carcinoma cell lines[J].Mol Pharmacol，2008，74（3）：724-735.

[8]周萍，付麗娟.羥基喜樹堿對乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因信號(hào)通路的影響研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，33（4）：83-87.

The detection of the TIMP-3expression and the cellular vaculization induced by HCPT detected with immunocytochemical method

PU Jinlan1ZHOU Ying2▲1.The Pharmacy Department of the People′s Hospital of Jiange County in Sichuan Province,Jiange 628300,China;2.College of Traditional Chinese Medical,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

ObjectiveTo explore the different concentration of HCPT effects on TIMP-3expression in breast tomor cell line MCF-7and the shapes of MCF-7cells were observed in this paper.MethodsMCF-7cell cultures were exposed to HCPT at concentrations of 10,40,80mg/L for 24h.PBS group as control group.Immunocytochemical method was used to measure the TIMP-3expression in breast tomor cell line MCF-7and the shapes of MCF-7cells for each sample.ResultsThe upregulated expression of TIMP-3in the MCF-7cell line could not be obviously induced by different concentration of HCPT,but the obvious presentation of the cellular vaculization could be induced by the cells of the disposed guoup of HCPT.ConclusionThe cellular vaculization for MCF-7cells can be induced by HCPT.

HCPT;Cellular vaculization;Immunocytochemical method;TIMP-3

R392-33

A

1674-4721（2012）09（a）-0007-02

重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（NO：2010-2-66）。

蒲錦蘭，主管中藥師，主要工作方向是藥劑科藥房工作及臨床藥學(xué)工作。

▲通訊作者：周瀅，博士，副教授。

2012-05-02 本文編輯：林利利）