EphB4／EphrinB2對血管生成的影響及中醫(yī)藥作用研究進展1）

胡雅瓊，張靜思，高 冬，宋 軍

血管生成的過程主要是血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管管腔形成的過程。缺血性疾病和腫瘤的生長都涉及血管生成。EphB4／EphrinB2獨特的雙向信號在血管生成過程中起著重要的雙向調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)對近年EphB4／EphrinB2在血管生成中的作用研究概述如下。

1 EphB4／EphrinB2的結(jié)構(gòu)和信號轉(zhuǎn)導

Eph受體是目前已知的酪氨酸激酶受體家族中最大的亞族，其家族成員眾多。自1987年，Hirai等［1］最先確定并描述了Eph亞族的第一個成員表征后，Brian等［2］于1994首次在人類CD34＋骨髓單核細胞和肝癌細胞株Hep3B中克隆出一種跨膜酪氨酸激酶蛋白，命名為肝癌跨膜蛋白激酶（hepatoma transmembrane kinase，Htk），即現(xiàn)在的EphB4。該受體具有與其他Eph受體家族成員相一致的跨膜蛋白結(jié)構(gòu)特點：由胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)組成，胞外區(qū)包含有一個球形配體結(jié)合域，一個富含半胱氨酸區(qū)和兩個纖維連接蛋白Ⅲ型（fibronectin typeⅢ，F(xiàn)NⅢ）重復(fù)序列；胞內(nèi)區(qū)包含一個近膜域，一個酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）域，一個SAM（sterile alpha motif）結(jié)構(gòu)域和一個PDZ（post－synaptic density protein，突觸后致密蛋白）結(jié)合域。EphB4的特異性配體EphrinB2于1995年被發(fā)現(xiàn)［3］，不同于可溶性配體，EphrinB2屬于跨膜蛋白，也含有胞外區(qū)、胞漿區(qū)、跨膜區(qū)。其胞內(nèi)區(qū)含酪氨酸、絲氨酸殘基和C端的PDZ結(jié)合域。除EphB4以外，EphrinB2還可以和B1、B3等其他的B類受體結(jié)合；但較其他配體而言，EphB4與EphrinB2的親和力最高。

由于EphB4和EphrinB2均屬于膜結(jié)合型蛋白，有別于其他酪氨酸激酶受體，它們在自身活化和信號轉(zhuǎn)導方面表現(xiàn)出獨特的方式，主要包括兩個方面。一方面，受體的激活依賴于表達配、受體細胞間的相互接觸；另一方面，EphB4和EphrinB2之間的信號轉(zhuǎn)導途徑是雙向的，在信號轉(zhuǎn)導過程中二者均可被對方激活，產(chǎn)生“正向信號”和“反向信號”。以EphrinB2為配體激活EphB4，引起受體自身磷酸化，進而激活下游 PI－3K、Src、MAPK、Akt等［4，5］不同途徑的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應(yīng)，此為正向信號，符合對經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導途徑的認識。相反的，以EphB4為配體結(jié)合 EphrinB2后，快速募集 SFKs（src－family kinases）到EphrinB2附近，將EphrinB2酪氨酸殘基磷酸化［6］，然后與接頭蛋白Grb4的SH2結(jié)構(gòu)域相結(jié)合激活下游信號通路［7］，此信號為反向信號。

2 EphB4／EphrinB2在血管生成中的作用

2．1 EphB4／EphrinB2在動靜脈分化中的作用 研究人員意外發(fā)現(xiàn)在胚胎血管新生的最早階段，動、靜脈內(nèi)皮細胞的基因表達出現(xiàn)差異：EphB4特異表達在靜脈內(nèi)皮細胞上；相反的，EphrinB2特異表達在動脈內(nèi)皮細胞上［8－10］。EphB4和EphrinB2這種顯著不對稱分布提供了最早區(qū)分動、靜脈內(nèi)皮的標記，也提示EphB4／EphrinB2的表達與胚胎動靜脈的形成有重要聯(lián)系。在斑馬魚胚胎中，背主動脈（dorsal aorta，DA）和尾側(cè)靜脈（caudal vein，CV）的形成來源于共同的血管原始細胞，CV由DA靜脈性成血管細胞遷移形成，當用嗎啉代寡核苷酸阻斷EphB4的表達時成血管細胞向CV的遷移量減少；與此相反，用嗎啉代寡核苷酸阻斷EphrinB2的表達會使成血管細胞向CV的遷移量增加，這些結(jié)果提示動、靜脈的正常分化需要EphB4和EphrinB2的正確表達［11］。EphB4或EphrinB2基因突變小鼠胚胎模型研究也支持了這一觀點，EphB4或EphrinB2基因缺失均會引起靜脈性ECs錯誤定位于DA上，導致小鼠胚胎雙側(cè)DA擴大，同時伴隨有主靜脈發(fā)育不全［12］。到成年階段，EphB4／EphrinB2動靜脈分布特異性減弱，EphrinB2仍舊持續(xù)表達于動脈，并且延伸至最小直徑的微血管和毛細血管，以及成年期血管新生部位，包括生理性和腫瘤性血管新生［13，14］；但與胚胎早期血管發(fā)育不同的是EphB4在成年血管的動脈、靜脈以及毛細血管的內(nèi)皮細胞上均有表達［15］。

2．2 EphB4／EphrinB2在卵黃囊血管重塑中的作用 EphrinB2和EphB4基因缺失不僅會引起E8．75～9．25小鼠胚胎動、靜脈分化異常［12］，同時抑制了隨后E9．5開始的動、靜脈血管重塑過程［9，10］。血管重塑是新的血管分支出芽、已有血管分支修整、鄰近的毛細血管融合或毛細血管分裂，使原有的簡單血管網(wǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛薪M織、高分支血管網(wǎng)的過程。正常小鼠胚胎卵黃囊血管重塑時動、靜脈出現(xiàn)廣泛地嵌合生長［9］，早期EphB4和EphrinB2分別特異地表達在動脈內(nèi)皮細胞與靜脈內(nèi)皮細胞上，但是在E9．5，EphB4可以點狀散在地表達于卵黃動脈及其他動脈［10］，這些都為EphB4和EphrinB2的結(jié)合與相互作用提供了條件。當EphrinB2基因缺失時，在E9．5，小鼠胚胎卵黃囊血管的重塑受到抑制，血管網(wǎng)復(fù)雜性和動靜脈嵌合度降低，胚胎在E11．5之前出現(xiàn)死亡［8，9］。同樣EphB4基因缺失也會抑制這一過程，出現(xiàn)毛細血管網(wǎng)的廣泛融合，產(chǎn)生與EphrinB2基因缺失類似的胚胎血管表型［10］。不僅如此，EphB4或EphrinB2基因缺失會引起動、靜脈血管重塑的雙重抑制，也進一步說明EphB4和EphrinB2的共同表達和相互作用對胚胎血管重塑的重要意義。

2．3 EphB4／EphrinB2在血管壁形成中的作用 在心血管系統(tǒng)，內(nèi)皮細胞形成血管腔的內(nèi)層，隨后募集周細胞和血管平滑肌細胞包覆內(nèi)皮層形成穩(wěn)定有功能的血管。在胚胎血管發(fā)育的早期，特異性敲除內(nèi)皮細胞EphrinB2基因會引起內(nèi)皮細胞突起和細胞間的連接廣泛消失，形成內(nèi)皮網(wǎng)的能力減弱，突變小鼠胚胎新生血管數(shù)顯著減少，在E15．5－18．5出現(xiàn)皮膚水腫和出血；如果誘導內(nèi)皮細胞EphrinB2過表達也會引發(fā)嚴重的血管缺陷，小鼠胚胎出現(xiàn)皮膚水腫和出血，胚胎于妊娠中期前出現(xiàn)死亡，延遲誘導可以推遲血管缺陷發(fā)生的時間從而延長胚胎存活時間［16］?？梢?，血管的正常發(fā)育需要內(nèi)皮細胞適時、適量地表達EphrinB2。

隨著胚胎發(fā)育的進行，EphrinB2的表達從動脈內(nèi)皮細胞逐步地擴展到周圍平滑肌細胞和周細胞，提示EphrinB2在動脈肌層的形成過程中可能起著重要作用［13］。周細胞和血管平滑肌細胞上EphrinB2基因失活的小鼠胚胎微血管中，周細胞與內(nèi)皮細胞松散連接，血管平滑肌細胞散在分布，二者不能完全包覆微血管，造成血管結(jié)構(gòu)不完整，在E18．5表現(xiàn)出組織水腫和廣泛的出血，即使能勉強發(fā)育至出生，出生后也會立即因呼吸衰竭而死亡［17］。EphrinB2廣泛過表達會導致平滑肌前體細胞至升主動脈募集異常，升主動脈血管平滑肌細胞缺失，被新生的微血管所取代，呈現(xiàn)出較薄的升主動脈，最終所有的轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎均死于新生兒期升主動脈夾層動脈瘤［18］。在腫瘤血管生成中，EphB4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細胞上的過度表達會導致腫瘤血管壁內(nèi)皮細胞增殖群集并與周細胞緊密連接，使腫瘤血管直徑擴大、滲透性降低，這些表現(xiàn)同樣出現(xiàn)在產(chǎn)后視網(wǎng)膜血管新生模型中［19］。

3 EphB4／EphrinB2雙向信號在血管新生中的作用

在原有毛細血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上，內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和出芽形成新的毛細血管是血管新生的一個重要過程。通過對EphB4胞內(nèi)信號缺失的內(nèi)皮細胞與SF126腫瘤細胞共植的小鼠模型血管新生表型研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤血管新生的啟動不依賴正向信號［19］。另一項研究中，反向信號缺失與EphrinB2基因失活的小鼠胚胎會產(chǎn)生相似的血管缺陷表型，提示胚胎血管正常發(fā)育需要反向信號［20］。似乎提示反向信號對血管新生具有更為重要的意義。為了更加清楚地認識正向信號在血管新生過程中的具體作用，Steinle等［4］用EphrinB2－Fc刺激正向信號會促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移。令人疑惑的是，有的實驗同樣是采用EphrinB2－Fc引發(fā)正向信號，卻產(chǎn)生抑制內(nèi)皮細胞增殖和遷移的作用［21－23］，而且這種矛盾的結(jié)論并不是偶然現(xiàn)象，在腫瘤細胞血管新生的研究中也出現(xiàn)了有爭議的結(jié)果。Noren等［24］研究發(fā)現(xiàn)，用截斷型EphB4△C轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞能夠促進表達Ephrin－B2的血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和存活，使腫瘤血管擴大和形成新的血管，增加腫瘤組織的血流量，進而加快腫瘤組織生長和定植，提示了EphB4激活反向信號促進血管新生的作用。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)B16惡性黑色素瘤細胞上EphB4的過表達會引發(fā)表達EphrinB2的動脈內(nèi)皮細胞凋亡，進而抑制腫瘤的血管新生［25］。在細胞共培養(yǎng)實驗中，表達EphB4的基質(zhì)細胞會抑制表達EphrinB2的內(nèi)皮細胞的增殖［26］。目前，相對較多學者認可的結(jié)論為內(nèi)皮細胞EphB4激活引發(fā)的正向信號介導抑制血管新生的作用，而內(nèi)皮細胞EphrinB2激活引發(fā)的反向信號介導促進血管新生的作用［21，22］。

雖然，關(guān)于EphB4／EphrinB2雙向信號在血管新生中的作用還存在很多爭議，但是其雙向信號產(chǎn)生相反的兩種血管新生效應(yīng)的結(jié)論是可以肯定的。

4 中醫(yī)藥影響血管新生的作用及展望

在促血管新生方面，對丹參提取物、三七皂苷、血府逐瘀湯和補陽還五湯等的研究發(fā)現(xiàn)，這些單味或復(fù)方中藥均能顯著提高血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）或bFGF的表達，從而產(chǎn)生促血管新生的作用［27－30］。在抗腫瘤血管新生研究中，徐曉玉等［31］證實川芎嗪能有效抑制小鼠Lewis肺癌細胞VEGF的表達，同時降低腫瘤組織內(nèi)微血管密度，產(chǎn)生抑制腫瘤生長的作用。陶厚權(quán)等［32］發(fā)現(xiàn)Rg3能有效抑制人胃癌的血管新生，提出這可能與Rg3減少VEGF和bFGF的表達有關(guān)。由此可見，中藥影響血管新生的機制研究主要還是局限于對常見生長因子的影響方面。由于血管新生調(diào)控因子眾多，且中藥作用呈多途徑、多靶點的特征，單從促進或抑制某個或某些常見生長因子的角度開展機制探討遠不能說明問題，還需要更多更新的視角來拓展思路。

在不同的組織中，同一種中藥表現(xiàn)出促血管新生和抗血管新生兩種截然相反的作用。王大英等［33］研究表明，麝香保心丸能夠促進血管新生從而降低大鼠心肌梗死面積，而在另一項研究中發(fā)現(xiàn)其能夠明顯抑制小鼠腫瘤組織的血管生成［34］。另一經(jīng)典復(fù)方血府逐瘀湯在缺血損傷早期能有效促進肉芽組織血管新生，但不能促進缺血下肢肌肉組織血管生長，隨著肉芽組織纖維化，血管閉合退化［35］，表現(xiàn)出藥物短暫促血管生長的特點，且體外初步研究結(jié)果顯示，血府逐瘀湯促血管新生作用呈倒U型藥效曲線，具有一個較適宜的濃度和時間點［36，37］。這些實驗結(jié)果表明中醫(yī)藥對血管新生的影響表現(xiàn)出適度生長的獨特調(diào)控。

已有初步的研究結(jié)果顯示Ephrin家族與此調(diào)控作用有關(guān)，血府逐瘀湯倒U型藥效曲線頂端最佳促血管新生條件下，EphrinA1表達下調(diào)，且曲線兩端對血管生長無明顯影響時，EphrinB2表達上調(diào)［36，37］，提示藥物可能通過激活正向信號的負性作用控制血管適度生長。在此線索指引下，該項目組正在進行血府逐瘀湯調(diào)控EphB4／EphrinB2雙向信號促進血管適度生長的機制研究，有助于加深對中醫(yī)藥調(diào)控血管新生的了解。雖然EphB4／EphrinB2及其雙向信號在中醫(yī)藥調(diào)控血管生長中的作用研究還處于起步階段，但我們希望能在這個工作的影響下，出現(xiàn)越來越多與中醫(yī)藥影響血管新生特點相符的線索更快地推動該領(lǐng)域研究工作的深入。

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