兩種PARP-1抑制劑對羥基喜樹堿誘導(dǎo)ECA-109細胞增殖及凋亡的影響

鄭永仁 何曉山 王 礡 楊曉密

云南中醫(yī)學(xué)院實驗中心，云南昆明 650500

喜樹堿（camptothecin，CPT）羥基喜樹堿（hydroxy camptothecin，HCPT）是一種植物抗癌藥物，在臨床上已廣泛用于食管癌、胃癌、腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤的治療[1-5]。盡管HCPT對于多數(shù)腫瘤細胞均有殺傷作用，但其不良反應(yīng)較多且嚴(yán)重，限制了它的臨床應(yīng)用。因此，探索其影響腫瘤作用的各種相關(guān)因素具有十分重要的意義。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]是一種多功能核蛋白，廣泛參與DNA損傷的識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，尤其在DNA的堿基切除修復(fù)過程中發(fā)揮著無法替代的作用，是當(dāng)今腫瘤基因治療的一個新靶點[6]。抑制PARP活性能降低腫瘤細胞的DNA修復(fù)功能，從而提高腫瘤放療和化療療效。研究表明，無論對于單一用藥或聯(lián)合化療藥物，PARP抑制劑都顯示了在抗腫瘤治療領(lǐng)域的潛力[7-8]。

NU1025和AG14361分別是第2代和第3代PARP抑制劑的代表，二者均能顯著提高化療藥物的細胞毒性作用，即對腫瘤細胞產(chǎn)生很強的化學(xué)致敏效果[9-10]。本研究探討了NU1025和AG14361與食管癌常用化療藥HCPT聯(lián)用對食管癌細胞ECA-109的增殖與凋亡的影響，并通過彗星實驗觀察細胞DNA損傷水平的變化，以初步探討二者與HCPT聯(lián)用的可能機制，為食管癌的臨床治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑

人食管癌細胞株ECA-109購買于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司生產(chǎn)。HCPT購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司（批號：0708G1，2mg/瓶）。NU1025（編 號：493800）和 AG14361（編號：S2178）分別為德國Merck公司和美國Selleck公司產(chǎn)品。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。四甲基偶氮唑藍（four methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）產(chǎn)自美國Sigma-Aldrich公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) ECA-109細胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)（含10%胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100 U/mL）于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天傳代1次。

1.2.2 MTT試驗 取對數(shù)生長期的ECA-109細胞，接種到96孔板（100 μL/孔，約3.0×103/孔），待細胞貼壁后進行實驗處理。HCPT濃度參照本課題組預(yù)實驗結(jié)果及國內(nèi)其他文獻報道，選用10 μmol/L。細胞隨機分成兩組，其中第1組采用以下方式處理：（1）對照組（不加任何處理）；（2）1.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）處理組；（3）5.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）處理組；（4）5.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）處理組。第 2 組采用以下方式處理：（1）對照組（不加任何處理）；（2）10 μmol/L HCPT 處 理 組；（3）HCPT+1.0 μmol/L NU1025（或 AG14361）處理組；（4）HCPT+5.0 μmol/L NU1025或 AG14361處理組；（5）HCPT+5.0 μmol/L NU1025（或AG14361）處理組。每組設(shè)6個平行孔，24 h后，每孔加入6 mg/mL的MTT 20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入150 μL二甲基亞砜溶解甲瓚結(jié)晶，后于酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光度OD值，計算細胞增值率。計算公式為：細胞增殖率=處理組OD值／對照組OD值×l00%。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的ECA-109細胞，以6×104個細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后進行處理。細胞分組按1.2.2第2組，按相應(yīng)方法處理ECA-109細胞24 h后收集細胞，制備成濃度為3.0×106/mL單細胞懸液，取80 μL細胞懸液，加入320 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混勻，室溫避光孵育20 min后，由專業(yè)技術(shù)人員檢測。

1.2.4 彗星實驗檢測細胞DNA損傷 選取對數(shù)生長期的ECA-109細胞，以3×104個細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后進行實驗處理。細胞分組按1.2.2第2組，按相應(yīng)方法處理ECA-109細胞24 h后收集細胞，制備單細胞懸液，參照文獻方法[11]，經(jīng)消化、解旋、電泳后，Gel-red核酸染料染色，熒光顯微鏡下觀察細胞彗星形態(tài)，每個濃度制備3張片子，每張片子統(tǒng)計100個彗星樣細胞，通過CASP彗星圖像分析軟件分別計算彗星圖像的頭部DNA百分率、尾部DNA百分率、尾矩和Olive尾矩，本研究以O(shè)live尾矩作為本實驗體系中評價細胞DNA損傷程度的指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0版軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料用（）的形式表示，行t檢驗，采用單因素方差分析比較各組間差異的顯著性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗結(jié)果

采用MTT法比較兩種PARP抑制劑單獨或聯(lián)合HCPT對ECA-109細胞增值率的影響，見圖1。ECA-109細胞被處理24 h后，除1.0 μmol/L NU1025處理組（P＞0.05）外的所有NU1025和AG14361處理組細胞增殖率均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的NU1025對細胞增殖的抑制作用分別為5%和9%，明顯小于5.0 μmol/L（10%）和10.0 μmol/L（17%）的AG14361對細胞增殖的抑制作用（P＜0.05）。MTT法比較兩種PARP抑制劑聯(lián)合HCPT對細胞增值率的影響，見圖2。

所有處理組（HCPT單獨處理組、HCPT+NU1025處理組和HCPT+AG14361處理組）細胞增殖率均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制劑聯(lián)合HCPT處理組細胞增殖率明顯低于HCPT單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中5.0 μmol/L和10.0 μmol/L NU1025聯(lián)合HCPT處理對ECA-109細胞增殖的抑制作用分別為29%和45%，明顯高于5.0 μmol/L（18%）和10.0 μmol/L（29%）的AG14361聯(lián)合HCPT處理，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 MTT試驗分析NU1025和AG14361處理24 h后ECA-109細胞增值率的變化。與對照組比較，*P＜0.05；相同濃度下NU1025組與AG14361組比較，△P＜0.05

圖2 MTT試驗分析HCPT聯(lián)合NU1025或AG14361處理24 h后ECA-109細胞凋亡率的變化。與對照組比較，*P＜0.05；與對HCPT處理組比較，#P＜0.05；相同濃度下NU1025組與AG14361組比較，△P＜0.05

2.2 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果

通過流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法進一步分析了HCPT聯(lián)合NU1025或AG14361對ECA-109細胞凋亡的影響，見圖3。ECA-109細胞被處理24 h后，所有處理組（HCPT單獨處理組、HCPT+NU1025處理組和HCPT+AG14361處理組）細胞凋亡率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制劑聯(lián)合HCPT處理組細胞增殖率明顯低于HCPT單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；其中 5.0 μmol/L和 10.0 μmol/L NU1025聯(lián)合HCPT分別誘導(dǎo)了32%和44%的ECA-109細胞凋亡，明顯強于5.0 μmol/L（18%）和10.0 μmol/L（30%）的AG14361聯(lián)合HCPT處理，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 流式細胞術(shù)分析HCPT聯(lián)合NU1025或AG14361處理24 h后ECA-109細胞凋亡率的變化。與對照組比較，*P＜0.05；與HCPT處理組比較，#P＜0.05；相同濃度下NU1025組與AG14361組比較，△P＜0.05

2.3 彗星實驗檢測結(jié)果

為明確NU1025和AG14361是通過何種方式起到增敏作用，通過彗星實驗評價了HCPT聯(lián)合NU1025或AG14361處理后ECA-109細胞DNA損傷程度的影響，見圖4。ECA-109細胞被處理24 h后，所有處理組（HCPT單獨處理組、HCPT+NU1025處理組和HCPT+AG14361處理組）細胞DNA損傷水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PARP抑制劑聯(lián)合HCPT處理組細胞DNA損傷程度明顯高于HCPT單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中5.0 μmol/L和10.0 μmol/L NU1025聯(lián)合HCPT對細胞DNA損傷的誘導(dǎo)作用明顯強于5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的AG14361聯(lián)合HCPT處理，前者分別為6.72和9.31，后者分別為5.34和6.91，前者相比與后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 彗星實驗分析HCPT聯(lián)合NU1025或AG14361處理24 h后的ECA-109細胞DNA損傷程度變化。與對照組比較，*P＜0.05；與HCPT處理組比較，#P＜0.05；相同濃度下NU1025組與AG14361組比較，△P＜0.05

3 討論

NU1025和AG14361均為新型PARP抑制劑，前者在低毒劑量時可使3-甲基吲哚誘導(dǎo)人支氣管上皮細胞（NHBE）DNA損傷水平增加1倍，后者在低毒劑量時則可使拓撲替康誘導(dǎo)的人白血病細胞（K562） 凋亡水平上升3倍以上[11-12]。盡管如此，由于不同PARP抑制劑的選擇性不同，在不同細胞株或與不同化療藥物（或放療）聯(lián)用時表現(xiàn)出的增敏效果也有所不同，因此，在不同實驗體系中的具體應(yīng)用仍需深入研究。

本研究以人食管癌細胞株ECA-109作為研究對象，探討NU1025和AG14361對HCPT誘導(dǎo)的細胞增殖和凋亡的影響。研究結(jié)果表明，NU1025和AG14361在單獨使用時，對ECA-109細胞增殖均起到了一定的抑制作用，且前者表現(xiàn)出較低的細胞毒性；但當(dāng)NU1025和AG14361分別與HCPT聯(lián)用時，和AG14361相比，NU1025表現(xiàn)出了更強的增敏作用[13]。通過流式細胞術(shù)凋亡分析實驗證實NU1025和AG14361分別與HCPT聯(lián)用時，NU1025表現(xiàn)出了更強的增敏作用。研究結(jié)果表明，NU1025和AG14361分別與HCPT聯(lián)用時，在5.0～10.0 μmol/L時，二者均明顯加重了HCPT誘導(dǎo)的ECA-109細胞DNA損傷效應(yīng)，相比于AG14361，NU1025對HCPT誘導(dǎo)的ECA-109細胞DNA損傷效應(yīng)表現(xiàn)出了更強的促進作用。因此，結(jié)合MTT和細胞凋亡研究結(jié)果，說明在本研究體系中，NU1025和AG14361通過抑制PARP-1的活性，阻礙了PARP-1對HCPT誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)作用，進而促進了細胞凋亡，降低了細胞增值率，且NU1025表現(xiàn)出了更強的作用，相關(guān)分子機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在5.0～10.0 μmol/L時濃度范圍內(nèi)的NU1025和AG14361均可顯著增強人食管癌細胞株ECA-109對HCPT的藥敏作用，且NU1025較AG14361具有更低的細胞毒性和更高的增敏作用的優(yōu)勢，為今后食管癌的藥物治療研究提供了一個可能的治療靶點[14-15]。

[1] 金學(xué)平，金學(xué)蘭.天然抗腫瘤藥物羥基喜樹堿的制備方法研究概況[J].中國藥業(yè)，2006，15（19）：63-64.

[2] S.P.Tu，J.Zhong，J.H.Tan，et al.Induction of apoptosis by arsenic trioxide and hydroxy camptothecin in gastriccancer cells in vitro[J].World J Gastroenterol，2000，6（4）：532-539.

[3] Y.R.Fu，Z.J.Yi，Y.R.Yan，et al.Hydroxycamptothecin-induced apoptosis in hepatoma SMMC-7721 cells and the role of mitochondrial pathway[J].Mitochondrion，2006，6（4）：211-217.

[4] 朱霞，李紅，楊峰.羥基喜樹堿治療晚期乳腺癌療效觀察[J].中國腫瘤，2004，13（1）：57-59.

[5] 荊孝東，趙積曄，李猛.羥基喜樹堿膀胱灌注預(yù)防膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的療效分析 [J].臨床外科雜志，2010，18（2）：131-132.

[6] 韓煒，鐘俊，王永峰，等.PARP抑制劑用于腫瘤治療的研究進展[J].中國新藥雜志，2011，20（12）：1086-1092.

[7] A.Peralta-Leal，J.M.Rodriguez-Vargas，R.Aguilar-Quesada，et al.PARP inhibitors:new partners in the therapy of cancer and inflammatory diseases[J].Free Radic Biol Med，2009，47（1）：13-26.

[8] A.J.Chalmers.The potential role and application of PARP inhibitors in cancer treatment[J].Br Med Bull，2009（89）：23-40.

[9] S.Boulton，L.C.Pemberton，J.K.Porteous，et al.Potentiation of temozolomideinduced cytotoxicity:a comparative study of the biological effects of poly（ADP-ribose） polymerase inhibitors[J].Br J Cancer，1995，72（4）：849-856.

[10] C.R.Calabrese，R.Almassy，S.Barton，et al.Anticancer chemosensitization and radiosensitization by the novel poly(ADP-ribose)polymerase-1 inhibitor AG14361 [J].J Natl Cancer Inst，2004，96（1）：56-67.

[11] L.A.Corcuera，L.Arbillaga，A.Vettorazzi，et al.Ochratoxin a reduces aflatoxin B1 induced DNA damage detected by the comet assay in Hep G2 cells[J].Food Chem Toxicol，2011，49（11）：2883-2889.

[12] 趙凌舟，張華北.抗腫瘤藥物PARP-1抑制劑及其放射性核素標(biāo)記的研究進展 [J].同位素，2011，24（S1）：45-58.

[13] 李思遠.吡柔比星與羥基喜樹堿治療淺表性膀胱癌術(shù)后的短期療效對比[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（15）：20-21.

[14] 聶先鋒.羥基喜樹堿治療難治復(fù)發(fā)性陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥的臨床分析 [J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（7）：32-33.

[15] 張徐龍，李海燕.羥基喜樹堿膀胱灌注防治膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的療效分析[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2010，8（18）：373-374.