HPLC法測定猴頭菌片中腺苷

顧慧芬， 莊意麗， 張夢玲

(上海市中藥研究所，上海201401)

猴頭菌片是采用與猴頭菌Hericium erinaceus(Bull．)Pers．有效成分相一致的猴頭菌菌絲體提取物制成的制劑。具有益氣補(bǔ)血、扶正培本、養(yǎng)胃護(hù)胃的作用，臨床上常用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍及慢性胃炎等，對多種消化道疾病均有較好的療效［1］。

猴頭菌片含多糖、多肽類、氨基酸等物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)，保護(hù)胃腸道等作用。猴頭菌絲體中含有較高含有量的腺苷［2-3］。腺苷具有廣闊的生理活性，包括鎮(zhèn)靜、擴(kuò)血管、抗缺氧［4］及較弱的抗炎、降膽固醇等作用?，F(xiàn)用標(biāo)準(zhǔn)主要是以多糖為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在猴頭菌片生產(chǎn)過程中由于輔料的加入干擾多糖含有量的準(zhǔn)確性，所以研究腺苷含有量指標(biāo)［5-6］作為一個復(fù)合的分析指標(biāo)具有較大意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1100高效液相色譜儀系統(tǒng)，Millipore Milli-Q超純水制備儀，CQ—6超聲波清洗器 (上海滬超超聲波儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;腺苷對照品 (中國藥品生物制品檢定所110879-200202);猴頭菌片 (由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格:0.26 g/片，批 號:08050102， 08080101， 08120101， 09030701，09070302，09100102，10040802，10050302，10030501)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱:(5 μm，4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇-0.01%乙酸(9∶91);檢測波長為260 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫25℃;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取恒質(zhì)量的腺苷對照品適量，置25 mL量瓶中，加15%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.016 mg/mL的腺苷對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品約0.5 g，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入15%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用15%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，3 000 r/min離心5 min，過濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，即得。

2.4 陰性空白樣品溶液的制備 稱取不含猴頭菌菌絲體的陰性空白樣品溶液，按照供試品溶液的制備方法制成陰性空白樣品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取腺苷對照品溶液、供試品溶液和陰性空白溶液各10 μL測繪HPLC圖譜。結(jié)果在對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上，有相同保留時間的色譜峰，而陰性空白樣品在腺苷出峰時間區(qū)域沒有干擾峰出現(xiàn)，故對腺苷的測定無干擾作用。見圖1。

2.6 線性關(guān)系的考察 將質(zhì)量濃度為0.003 2 mg/mL的腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，HPLC分別進(jìn)樣2、5、8、10、15、30 μL，以腺苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) (x)，以測定的腺苷峰面積積分值為縱坐標(biāo) (y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:y=10.3x－1.24，r=0.999。結(jié)果表明腺苷在0.006 4～0.096 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取腺苷對照品10 μL，按2.1項(xiàng)色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定腺苷峰面積，RSD值為1.7%。說明儀器性能良好，符合定量分析的要求。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號供試樣品1份，按2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法，制備成供試液，在常溫下放置24 h，于0、2、4、6、8、10、24 h分別進(jìn)樣10 μL，測得的峰面積RSD為1.2%，結(jié)果表明樣品溶液中的腺苷，在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品6份，按2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法，制備成供試液，平行測定6次，結(jié)果測得峰面積RSD為0.85%(n=6)，說明方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的供試樣品9份，分別加入一定量的腺苷對照品，按2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法，在腺苷的線性范圍內(nèi)分別制成低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的溶液 (每一種質(zhì)量濃度3份)。分別進(jìn)樣，測定峰面積及標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表1。

圖1 對照品溶液 (A)、供試品溶液(B)和陰性樣品溶液 (C)HPLC色譜圖

表1 回收率測定結(jié)果

2.11 樣品的測定 精密稱取9批猴頭菌片0.5 g，按2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法，制備成供試品溶液。以質(zhì)量濃度為0.016 mg/mL的腺苷為對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定腺苷峰面積，計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論

猴頭菌片是由固體培養(yǎng)菌絲體經(jīng)熱水浸提，濃縮而制成的片劑。其藥效是各組成成分復(fù)雜的綜合作用，含有多糖、氨基酸等物質(zhì)，還含有較高含有量的腺苷。本實(shí)驗(yàn)研究表明，猴頭菌片中含有相當(dāng)含有量的腺苷?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道HPLC法測定腺苷方法很多［7-12］，但用于本制劑測定，分離效果不理想。由于腺苷為水溶性物質(zhì)，且較穩(wěn)定的特性，本實(shí)驗(yàn)采用適當(dāng)?shù)奶崛》蛛x方法，用高效液相色譜法測定猴頭菌片中腺苷結(jié)果較滿意。測定結(jié)果表明，在9批猴頭菌片中，腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.148 0～0.209 2 mg/g。本研究方法簡便、快速，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且不同批次之間腺苷含量較穩(wěn)定，可用于猴頭菌片的質(zhì)量控制。

猴頭菌片現(xiàn)用標(biāo)準(zhǔn)主要是以多糖為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)過程中由于輔料的加入干擾多糖含有量的準(zhǔn)確性，研究猴頭菌片腺苷含有量指標(biāo)與多糖一起成為產(chǎn)品復(fù)合式的質(zhì)量分析指標(biāo)，對提高產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性具有較大意義，為猴頭菌片質(zhì)量的提高及標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

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