HPLC法測(cè)定西藏野生和人工種植喜馬拉雅紫茉莉中葫蘆巴堿

劉 青， 達(dá)瓦潘多， 央 美， 頓珠次仁， 仁 增， 索朗其美

(西藏藏醫(yī)學(xué)院，西藏拉薩850000)

喜馬拉雅紫茉莉 (巴朱)為紫茉莉科植物喜馬拉雅紫茉莉 Mirabilis himalaica(Edegw．)Heim．的干燥根［1］。該藏藥具有溫腎、益腎滋補(bǔ)、生肌、利尿、排石等功效，用于胃寒、腎寒、下身寒、陽(yáng)萎浮腫等［1-3］，喜馬拉雅紫茉莉作為藏藥使用歷史悠久，始見(jiàn)于《月王藥珍》［4］，藏醫(yī)藥名著《四部醫(yī)典》和《晶珠本草》均有記載［2-5］。對(duì)于紫茉莉?qū)僦参锔泻锌怪参锊《尽⒖咕牡鞍壮煞?、氨基酸、有機(jī)酸、豆甾醇、β-谷甾醇、葫蘆巴堿、半乳糖、淀粉、樹(shù)脂等和揮發(fā)油成分［6-11］早有研究報(bào)道。作為藏藥藥用的紫茉莉?qū)僦参锵柴R拉雅紫茉莉在臨床應(yīng)用范圍廣，臨床上常見(jiàn)的十五味兒茶丸、巴桑母酥油丸、二十五味鬼臼丸、熱巴羅布膏等劑型作為主要的原料之一，資源緊缺，屬于藏藥瀕危物種之一。2003年由西藏藏醫(yī)學(xué)院索朗其美教授主持的人工種植喜馬拉雅紫茉莉作為西藏高原瀕危藏藥材人工種植栽培技術(shù)項(xiàng)目之一，并獲得該種植技術(shù)的項(xiàng)目專(zhuān)利，于2006年順利通過(guò)西藏自治區(qū)科技廳結(jié)題驗(yàn)收。為保證喜馬拉雅紫茉莉用于臨床品種的質(zhì)量，對(duì)野生和人工種植喜馬拉雅紫茉莉中葫蘆巴堿［10］進(jìn)行定量測(cè)定［11］。

1 儀器與材料

梅特勒AE200電子天平;島津LC—20A液相色譜儀，配SPD—20AV紫外可見(jiàn)檢測(cè)器;ASI0200BDT超聲波清洗器 (250W，天津奧特賽恩斯儀器有限公司);UV—2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京萊伯泰科技儀器有限公司)。乙酸、甲醇 (色譜純)，乙腈 (色譜純，F(xiàn)isher公司);優(yōu)普超純水機(jī) (蒸餾水自制)。葫蘆巴堿 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110813-200502)。喜馬拉雅紫茉莉野生和人工種植品由西藏藏醫(yī)學(xué)院研究所提供，經(jīng)西藏藏醫(yī)學(xué)院科研所索朗其美教授鑒定為紫茉莉科植物喜馬拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica(Edegw．)Heim．的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shim-pack VP-ODS色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)，柱溫40℃;體積流量0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm。

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加甲醇8 mL，20℃超聲處理 (功率250 W，頻率55 kHz)40 min，靜置室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取葫蘆巴堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL中含13.75 μg的溶液，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液及供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)得HPLC圖譜，見(jiàn)圖1。理論塔板數(shù)按葫蘆巴堿峰計(jì)算不低于4 000。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密配制系列質(zhì)量濃度的葫蘆巴堿對(duì)照 品 溶 液:3.44、13.75、31.43、55.00、110.00 μg/mL，分別精密進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，計(jì)算，得回歸方程為:y=8.008 41×10－5x+1.702 816，相關(guān)系數(shù)R=0.999 8，表明葫蘆巴堿在3.44～110 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取葫蘆巴堿對(duì)照品溶液10 μL(13.75 μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣 5次，測(cè)定其峰面積，RSD為1.43%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品 (批號(hào)2011092301)按2.2項(xiàng)方法制備，分別在0、2、4、6、10、12 h測(cè)定，結(jié)果葫蘆巴堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.42%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品 (批號(hào)2011092301)樣品6份，按2.2項(xiàng)制備，制得6份供試品溶液，按樣品測(cè)定法測(cè)定峰面積，測(cè)得供試品中葫蘆巴堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.21 mg/g(RSD=1.8%，n=6)，表明本法重復(fù)性較好。

圖1 高效液相色譜圖

2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱(chēng)取適量的已測(cè)知含有量的樣品 (葫蘆巴堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.260 4 mg/g;批號(hào)2011092302)6份，分為低、中、高3組，分別精密加入葫蘆巴堿對(duì)照品溶液 13.75 μg/mL、20 μg/mL、25.88 μg/mL各1 mL，按2.2項(xiàng)制樣并測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定 取野生及人工種植藥材 (各3份)，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算其中葫蘆巴堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=6)

3 討論

根據(jù)參考文獻(xiàn)，宋粉云等［12］采用HPLC法測(cè)定了紫茉莉根中葫蘆巴堿。結(jié)合多次的實(shí)驗(yàn)條件摸索，比較不同比例 的 乙 腈-0.03% 乙 酸 (20∶80)、乙 腈-0.03% 乙 酸(10∶90)、乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)等流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)葫蘆巴堿峰與雜質(zhì)峰的分離度、保留時(shí)間、理論板數(shù)等的影響。發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相乙腈-0.03%乙酸 (5∶95)能保證葫蘆巴堿峰與雜質(zhì)峰的分離度、理論板數(shù)均達(dá)到較好;比較了葫蘆巴堿于265 nm及214 nm處的吸光度值，結(jié)果在265 nm處有較高的吸收。

現(xiàn)代藥理研究表明，葫蘆巴堿是一種兩性化合物，以?xún)?nèi)鹽的形式存在。葫蘆巴堿不但具有抗腫瘤的活性，也是一種具有降低血糖功效的活性物質(zhì)［13］，針對(duì)上述藥理作用，人工種植喜馬拉雅紫茉莉中葫蘆巴堿的量高于野生喜馬拉雅紫茉莉中葫蘆巴堿的量。對(duì)于其它的主要成分，將進(jìn)一步的比較和研究，為藏藥喜馬拉雅紫茉莉在臨床上合理、有效、安全使用提供理論依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥．第一冊(cè)［S］．1995:104．

［2］中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所．藏藥志［M］．西寧:青海人民出版社，1991:461．

［3］青海省藥品檢驗(yàn)所，青海省藏醫(yī)藥研究所．中國(guó)藏藥:第一卷［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1996:303．

［4］衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所．中國(guó)民族藥志:第二卷［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，1990:348．

［5］宇妥·元丹貢布．四部醫(yī)典［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987:165．

［6］李光喜，楊培全．紫茉莉?qū)偎幱弥参镅芯窟M(jìn)展［J］．廣東醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，10(4):251-253．

［7］Ahmad M S，Ranf A，Mustafa J，et al．An 8-hyydroxy octadeca-CIS-11，14-dienoic from Mirabilis jalapa seed oil［J］．Phyto Chem，1984，23:2247-2249．

［8］危 英，楊小生，郝小江，等．紫茉莉根的化學(xué)成分［J］．中國(guó)中藥雜志，2003，28(12):1151-1152．

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［10］王 琳，楊德成，江金霖，等．紫茉莉?qū)僦参锏幕瘜W(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010，19(7):31-34．

［11］鞏 江，王聰聰，倪土峰，等．國(guó)產(chǎn)紫茉莉?qū)僦参锼帉W(xué)研究［J］安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2009，37(13):5959-5960．

［12］宋粉云，張德志，鐘遠(yuǎn)香，等．HPLC法測(cè)定紫茉莉根中葫蘆巴堿的含量［J］．中藥新藥與臨床藥理，2005，16(3):189-191．

［13］趙懷清，曲 燕，王學(xué)婭，等．葫蘆巴堿的HPLC法測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(4):279-282．