UPLC法同時測定炒蒼耳子配方顆粒中5種酚酸類成分

秦泗漣， 馬利華， 王振中， 陳 斌， 謝東浩， 賈曉斌*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222047;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇南京210028;3.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

蒼耳子系菊科植物蒼耳Xanthium sibiricum Part．的干燥成熟帶總苞的果實，收載于2010年版《中國藥典》，為常用中藥材。味辛、苦，性溫，有毒，歸肺經(jīng)。具有散風(fēng)除濕、通鼻開竅的功效，臨床上主要用于治療風(fēng)寒頭痛、鼻淵流涕、風(fēng)疹瘙癢和濕痹拘攣等癥［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蒼耳子中含有大量的酚酸類化合物［2］，據(jù)報道［3］，從蒼耳子抗炎活性部位中分離得到的酚酸類化合物有咖啡酸、綠原酸、1，5-O-二咖啡酸奎寧酸、4-O-咖啡?？鼘幩岬?。藥理試驗表明以綠原酸為代表的咖啡酰奎寧酸類化合物具有抗菌、抗病毒、抗氧化等多種生物活性，多種成分的配伍是蒼耳子發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前臨床處方中蒼耳子皆為蒼耳子的炮制品，即炒蒼耳子。炒蒼耳子一般要求炒后碾去刺入藥，生品慎用。其炮制的目的主要是為了降低毒性，并易于去刺和潔凈藥物［4］。炒蒼耳子配方顆粒是其生品按《中國藥典》規(guī)定炒制后，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等工序制成的單味中藥配方顆粒劑。其中的酚酸類成分具有多種生物活性，是發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此可考慮作為其顆粒劑定量測定的指標(biāo)成分。本研究采用UPLC同時測定其中5種酚酸類化合物，該方法靈敏、高效、準(zhǔn)確，可為炒蒼耳子配方顆粒的質(zhì)量控制提供快速準(zhǔn)確的檢測方法。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC(美國Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower2色譜工作站)，梅特勒萬分之一電子天平，millipore超濾儀。

炒蒼耳子配方顆粒，購于江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司(批號1010158、1012058、1001093，每包0.5 g，相當(dāng)于10 g藥材)。綠原酸 (中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413，純度98.7%)、咖啡酸 (中國藥品生物制品檢定所，批號110885-200102，純度99.1%)、新綠原酸、隱綠原酸和洋薊素 (批號分別為:N100620、C100616、D100429，純度≥99.3%)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜方法 ACQUITY BEH C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相A為0.1%乙酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫，0～2 min，3% ～7%B;2～10 min，7% ～15%B;體積流量0.4 mL/min;柱溫為40℃;檢測波長325 nm。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、新綠原酸、隱綠原酸和洋薊素 2.74、1.68、2.74、2.81、2.35 mg置于5 mL棕色量瓶中，加少量甲醇溶解后用3%甲醇定容，制得各對照品貯備液。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取炒蒼耳子配方顆粒0.5 g，置于50 mL量瓶中，加50%甲醇定容，密塞，稱其質(zhì)量，超聲提取60 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液離心即得。

2.3 線性關(guān)系考察 取2.2.1項下各對照品母液新綠原酸3.5 mL、綠原酸2.8 mL、咖啡酸0.3 mL、隱綠原酸1.2 mL和洋薊素1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，3%甲醇定容制得混合對照品母液，將混合對照品溶液分別精密量取5、1、0.5、0.2、0.1 mL置于10 mL棕色量瓶中定容，得到一系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，離心后按2.1項下色譜條件，進(jìn)樣4 μL。以峰面積積分 (Y)對質(zhì)量濃度 (X)進(jìn)行線性回歸，得到5種酚酸類成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限，見表1。

表1 各成分線性回歸數(shù)據(jù)、檢測限和定量限

2.4 精密度 按2.2.2項下制備供試品溶液 (批號1010158)，分別精密吸取3 μL，以2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算其RSD分別為0.481 2%、0.942 7%、0.671 6%、1.754%、1.572%，表明儀器的精密度良好。

2.5 重復(fù)性 精密稱定同一批樣品 (批號1010158)，分別制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣4 μL，測定峰面積，計算其 RSD分別為2.460%、2.534%、1.712%、2.441%、1.834%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性 精密吸取同一批供試品溶液4 μL分別于配制后0、2、4、6、8 h時進(jìn)樣，測定峰面積，計算其RSD分別為0.231 4%、1.253%、1.972%、1.704%、0.921 7%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)各成分是穩(wěn)定的。

2.7 加樣回收率 取同一批號 (批號1010158)已測定的供試品6份，分別精密加入等同于藥材樣品含有量的5種化學(xué)對照品，按2.2.2項下方法制備，以2.1項下色譜條件進(jìn)樣4 μL，測定新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、洋薊素。結(jié)果表明，本法準(zhǔn)確度較好，見表2。

2.8 樣品的測定 取在有效期內(nèi)不同生產(chǎn)日期的3批炒蒼耳子配方顆粒，按2.2.2項下方法和2.1項色譜條件進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率測定結(jié)果(n=6)

表3 樣品中5種酚酸類化合物定量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

目前，炒蒼耳子配方顆粒的質(zhì)量控制只有關(guān)于綠原酸和咖啡酸定量測定的報道，而中藥所含化學(xué)成分非常復(fù)雜，其藥效的發(fā)揮往往是多種活性成分共同作用的結(jié)果。傳統(tǒng)單獨追求單個指標(biāo)成分作為中藥質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)，不能完全體現(xiàn)中藥整體性的特征，因此，中藥配方顆粒建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)高于現(xiàn)行的中成藥的標(biāo)準(zhǔn)，含測成分應(yīng)盡可能的多，以保證其有效性。

隨著人們生活節(jié)奏的加快，單味配方顆粒在臨床上的應(yīng)用逐漸受到重視。中藥配方顆粒改變了傳統(tǒng)中藥飲片體積大，不宜貯存的缺點，是中藥飲片的一種現(xiàn)代應(yīng)用形式，具有攜帶保存方便、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點。臨床上常見的配方顆粒有黃連、魚腥草、枳實、吳茱萸等，關(guān)于配方顆粒的質(zhì)量控制已有文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)報道，如李霞等［5］對五味子配方顆粒的工藝規(guī)范化進(jìn)行研究;陳彥等［6］采用高效液相色譜法測定仙靈脾配方顆粒5種主要黃酮類成分的等，這些都為中藥配方顆粒的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

本實驗以炒蒼耳子單味配方顆粒為研究對象，通過預(yù)實驗優(yōu)化實驗條件，選取綠原酸等5種酚酸類化合物為檢測指標(biāo)，通過定量測定來控制顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。結(jié)果表明同一廠家不同批號炒蒼耳子配方顆粒中5種酚酸類化合物的含有量存在一定差異;不同批號間一種指標(biāo)成分含有量高，而其他指標(biāo)成分含有量相對也高，這可能與蒼耳子的采收季節(jié)，來源及加工過程有關(guān)。將3個批號樣品中所含5種酚酸類化合物進(jìn)行平均，其含有量僅相當(dāng)于同等生藥的10% ～15%［7］，說明該配方顆粒在加工過程中可能有大部分成分的丟失，導(dǎo)致指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率降低。本實驗優(yōu)化液相條件，10 min內(nèi)同時測定了炒蒼耳子配方顆粒中5種綠原酸類化合物，分析時間短，準(zhǔn)確性高，目前并沒有相關(guān)的報道。本課題組還曾分析配方顆粒的存在問題，提出了“四個標(biāo)準(zhǔn)化和一個還需要”［8］，指出中藥配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)化是臨床療效的基礎(chǔ)。因此，建議進(jìn)一步完善制備工藝，建立多成分質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，全面控制炒蒼耳子配方顆粒的質(zhì)量，以確保其臨床療效的可靠性與一致性。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:151．

［2］韓 婷，李慧梁，胡 園，等．蒼耳子中酚酸類化合物及不同品種和居群蒼耳子中總酚酸含量的測定［J］．中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2006，4(2):194-198．

［3］韓 婷．蒼耳子的生物活性成分及品質(zhì)評價［D］．上海:第二軍醫(yī)大學(xué)，2006．

［4］吳懷恩，韋志英，韋建華，等．HPLC測定炒蒼耳子配方顆粒中綠原酸及咖啡酸的含量［J］．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27(8):744-746．

［5］李 霞，賈曉斌，陳 彥，等．五味子配方顆粒工藝規(guī)范化研究［J］．中國中藥雜志，2006，31(24):2078-2079．

［6］陳 彥，蔡 垠，賈曉斌，等．高效液相色譜法測定仙靈脾配顆粒中5種主要黃酮類成分的含量［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2007，13(11):1-3．

［7］楊 柳，蘇芝軍，徐舜軍，等．UPLC法同時測定蒼耳子中4種酚酸類成分的含量［J］．藥學(xué)學(xué)報，2010，45(12):1537-1540．

［8］賈曉斌，黃麗霞，陳 彥，等．中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)化是臨床療效的基礎(chǔ)［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(6):1200-1202．