桔梗邊角料中桔梗多糖的分離純化研究

華 芳， 王舉濤， 桂雙英，2，3*

(1.安徽中醫(yī)學院藥學院，安徽合肥230031;2.安徽省中藥制劑工程技術研究中心，安徽合肥230031;3.現代中藥安徽省重點實驗室，安徽合肥230031)

桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodon gradiflorum(Jacq．)A．DC．的干燥根，性平，味苦、辛，具有化痰止咳、利咽開音、宣暢肺氣、排膿消癰的功效。桔梗中主要含有三萜皂苷、多糖類化合物、黃酮類化合物等成分［1-2］。桔梗多糖具有免疫調節(jié)、抗炎、祛痰、保肝、降血脂、抗氧化等方面的藥理作用［3］。桔梗邊角料 (包括須根、皮等)和地上部分 (莖、葉等)一般都是丟棄不用，在一定程度上造成了資源的浪費。因此，本實驗以桔梗邊角料為原料對其多糖進行分離純化研究。

1 材料與儀器

桔梗邊角料 (安徽省太和縣利民中藥材有限責任公司提供);DEAE-52纖維素、葡聚糖凝膠G-200(北京瑞達恒輝公司提供)，其余試劑均為分析純。紫外可見分光光度計 (上海精科UV757)，Agilent 1100 HPLC色譜儀。

2 方法

2.1 提?。?］稱取桔梗邊角料10 g，加25倍水，80℃提取3次，每次1 h，合并提取液，放冷，取上清液濃縮，加入乙醇至含醇量80%，靜置24 h，抽濾，濾餅加水至完全溶解，濃縮，加乙醇至含醇量80%，靜置24 h，抽濾，50℃減壓干燥。粗多糖得率7.97%。

2.2 分離純化研究

2.2.1 脫蛋白工藝考察［5-6］取粗多糖2份，精密稱定，加蒸餾水溶解，定容至100 mL，一份按照V樣品∶V試劑為5∶1的比例加入Sevag試劑 (V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)萃取3次，取上層液，濃縮;另一份加入10%三氯乙酸，靜置24 h，離心 (4 000 r/min，10 min)，取上清液，用10%NaOH溶液調pH至7。結果見表1。

表1 2種不同方法脫蛋白的效果比較 (n=3)

由表1可知，Sevag法脫蛋白效果更好。

2.2.2 脫色工藝考察［7-8］取脫蛋白后的多糖溶液，濃縮，分別加入1%、2%、3%的活性炭，于80℃下水浴30 min，過濾。結果見表2。

表2 3種不同質量分數活性炭脫色的效果比較 (n=3)

由表2可知，2%活性炭，80℃水浴脫色30 min為桔梗多糖的最佳脫色工藝。

2.2.3 DEAE-52纖維素柱層析［9-10］取上述脫蛋白、脫色的桔梗多糖樣品上 DEAE-52纖維素柱，依次用蒸餾水、0.05 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫。每2 mL為一個流份，隔管采用苯酚-濃硫酸法在486 nm的波長下測定吸光度值，至無多糖檢出時更換至下一梯度洗脫，繪制洗脫曲線見圖1、圖2。

圖1 桔梗中性多糖DEAE-52洗脫曲線

圖2 桔梗酸性多糖DEAE-52洗脫曲線

由洗脫曲線可知有一個桔梗中性多糖，3個桔梗酸性多糖，4個組分分別命名為 PG、PG1、PG2、PG3。由于PG1、PG3峰值較小，僅對PG、PG2作進一步研究。

2.2.4 SephadexG-200凝膠柱層析 PG、PG2分別過SephadexG-200凝膠柱，每2 mL一管，苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測，繪制洗脫曲線見圖3、圖4，所示仍然為一個單一對稱的洗脫峰，這說明PG、PG2在相對分子質量分布上都是均一的多糖。

2.3 PG單糖組成分析［11-13］

2.3.1 酸水解 精密稱取PG，加入1 mol/L稀鹽酸沸水浴下水解，冷卻后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液中和后減壓濃縮至干燥。

2.3.2 薄層層析 取酸水解后的樣品10.0 mg，加1 mL甲醇配成10 mg/mL的PG水解樣品溶液。分別稱取葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖各10.0 mg，分別加入1 mL甲醇，配成10 mg/mL的標準單糖溶液。展開劑為正丁醇-冰醋酸-水 (4∶1∶5)(上層)。顯色劑為α-萘酚-硫酸。結果見圖5。

圖3 PG SephadexG-200洗脫曲線

圖4 PG2 SephadexG-200洗脫曲線

圖5 桔梗多糖薄層色譜圖

由圖5可知，PG水解物在果糖相對應的位置顯相同的藍色斑點，由此推斷PG主要由果糖組成。

2.4 PG相對分子質量測定

2.4.1 色譜條件 SHODEX PROTEIN KW-802.5凝膠色譜柱，G1362A示差折光檢測器，流動相為100%水，體積流量為1.0 mL/min，柱為30℃。

2.4.2 標準曲線的制備 供相對分子質量測定用右旋糖酐對照品 (對相對應分子質量為20 000、40 000、50 000)，配制成質量濃度為1 mg/mL的對照品系列溶液。以色譜峰的保留時間 (t)為橫坐標，標準分子量的對數值 (lgMw)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為lgMw=－0.033 2x+5.672 7(R=0.996)。

2.4.3 樣品測定 精密稱取PG，用流動相配制成質量濃度為1 mg/mL的樣品液，進樣，測得保留時間為48.304 min，見圖6所示，通過外推法得出PG的相對分子質量為11 749。

3 討論

圖6 PG的GPC色譜圖

3.1 Sevag法脫蛋白具有條件比較溫和，對桔梗多糖脫蛋白率高而多糖損失率低的特點，所以適用于桔梗多糖中蛋白質的去除。

3.2 桔梗粗多糖經過DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-200凝膠柱，得到的兩種多糖均為單一對稱的洗脫峰，所以為均一的多糖組分，其中PG的相對分子質量為11 749，由于PG2通過DEAE-52纖維素柱洗脫后含有大量的NaCl，影響TLC及相對分子質量的測定，因此還需要進一步進行脫鹽處理，所以PG2的相對分子質量及其結構分析將在后期進行研究。

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