HPLC法測(cè)定蜜炙款冬花中4種黃酮類成分

王福剛， 曹 娟， 齊永秀， 鈕厚發(fā)

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016)

款冬花為菊科款冬屬植物款冬Tussilago farfara L．的干燥花蕾，又稱冬花、虎須、九盡草［1］，性辛，微苦，溫，歸肺經(jīng)，具有潤(rùn)肺下氣，止咳化痰之功效。臨床上主要用于新久咳嗽，咳喘痰多，勞嗽咳血［2］，為止咳平喘方劑中的常用藥。本品已報(bào)道的化學(xué)成分包括萜類，黃酮類，生物堿，多酚類，揮發(fā)油等［3-7］，已有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法分別測(cè)定款冬花中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷［8-12］?？疃ǔＲ云渑谥破贰壑丝疃ㄈ胨?，有關(guān)蜜炙款冬花的研究文獻(xiàn)報(bào)道不多。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定蜜炙款冬花中4種黃酮類化合物的方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC—10Avp高效液相色譜泵，SPD—10Avp紫外檢測(cè)器，N2000色譜工作站 (日本島津);FA1004電子天平 (上海蘭科儀器有限公司);KQ—500DB超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

對(duì)照品蘆丁 (批號(hào):100080-200707)、槲皮素(批號(hào):100081-200907)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。山柰酚 (純度 98%)、金絲桃苷 (純度98%)購(gòu)于天津一方科技有限公司。

款冬花01(產(chǎn)地山西)購(gòu)于濟(jì)南建聯(lián)大藥房，款冬花02(產(chǎn)地河北)購(gòu)于山東省中醫(yī)院藥房，款冬花03(產(chǎn)地河北)購(gòu)于山東天一中藥飲片有限公司。

蜜炙款冬花1、蜜炙款冬花2、蜜炙款冬花3分別為款冬花01、02、03按《中國(guó)藥典》2010年版一部蜜炙炙法自制。蜜炙款冬花04(產(chǎn)地重慶)購(gòu)于泰安中心醫(yī)院藥房，蜜炙款冬花05(產(chǎn)地陜西)購(gòu)于濟(jì)南同仁堂藥店，蜜炙款冬花06(產(chǎn)地河南)購(gòu)于泰安市龍?zhí)洞笏幍?，蜜炙款冬?7(產(chǎn)地甘肅)購(gòu)于泰安市綠地大藥房，蜜炙款冬花08(產(chǎn)地安徽)購(gòu)于安徽頤生堂中藥飲片有限公司，蜜炙款冬花09(產(chǎn)地山東)購(gòu)于山東鄄城志遠(yuǎn)中藥飲片有限公司，蜜炙款冬花10(產(chǎn)地山東)購(gòu)于山東永春堂中藥飲片有限公司，蜜炙款冬花11(產(chǎn)地河南)購(gòu)于泰山為民大藥房，蜜炙款冬花12(產(chǎn)地河南)購(gòu)于泰安益民藥店，經(jīng)本院生藥教研室鑒定均為菊科植物款冬Tussilago farfara L．的花蕾。

甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為大連依利特C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相A為0.1%磷酸，B為乙腈，梯度洗脫，0～30 min、10% ～25%B，30～40 min、25% ～75%B，40～50 min、75% ～100%B，50～60 min、100%B;檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm;體積流量1.0 mL/min;室溫;進(jìn)樣量20 μL。在上述色譜條件下得到的對(duì)照品及樣品的色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A)和供試品 (B)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.2 混合對(duì)照品貯備液的制備 取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚對(duì)照品適量，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為2.05、1.05、0.47、0.32 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密量取各質(zhì)照品溶液5 mL置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為410、210、94、64 μg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 取蜜炙款冬花藥材粉末(過三號(hào)篩)1 g，精密稱定，加入20 mL乙醇，超聲1 h，濾過，乙醇定容至25 mL，搖勻，精密量取5 mL，水浴蒸干，用5 mL乙腈溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 依次精密吸取混合對(duì)照品貯備液 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分別置 25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:蘆丁Y=16 656 963.05X+33 676.05(r=0.999 3);金絲桃苷 Y=30 982 497.84X+65 144.46(r=0.999 0);槲皮素 Y =39 406 527.14X + 110 815.92 (r=0.999 3);山柰酚Y=46 630 399.82X+66 058.63(r=0.999 2);表明蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚分別在 1.64 ～164 μg/mL、0.84 ～84 μg/mL、0.376 ～37.6 μg/mL、0.256 ～25.6 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液 (蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山奈酚的質(zhì)量濃度分別為410、210、94、64 μg/mL)，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚的峰面積RSD分別為1.4%、2.1%、1.8%、1.1%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取蜜炙款冬花01號(hào)藥材粉末(過三號(hào)篩)，按2.3項(xiàng)下方法操作，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.5%、1.9%、2.5%、3.0%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蜜炙款冬花01號(hào)樣品的供試品溶液，室溫放置，按2.1項(xiàng)色譜條件，分別于0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣分析，計(jì)算蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚色譜峰面積RSD分別為2.1%、1.5%、3.1%、2.9%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取蜜炙款冬花01號(hào)樣品9份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表1。

2.9 樣品測(cè)定 取不同來源的款冬花、蜜炙款冬花各3份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，計(jì)算蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了220、240、280、320、350 nm多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果240 nm時(shí)，樣品中質(zhì)量濃度較小的槲皮素有較大吸收值，峰形良好，選定為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Determination of samples(n=3)

3.2 提取方法的選擇 考察了不同提取方法 (超聲、回流、冷浸)、不同溶劑 (不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇)、不同提取時(shí)間、不同料液比對(duì)款冬花中黃酮類成分提取率的影響，結(jié)果采用95%乙醇，料液比1∶20，超聲提取1 h，黃酮類成分提取率最高。

3.3 色譜條件的選擇 考察了不同系統(tǒng)的流動(dòng)相，比較了磷酸-乙腈系統(tǒng)、冰醋酸-乙腈系統(tǒng)、甲酸-乙腈系統(tǒng)、磷酸-甲醇-乙腈系統(tǒng)，結(jié)果表明，在0.1%磷酸-乙腈洗脫條件下，4種黃酮類成分峰分離度較好;另外還對(duì)多個(gè)不同的洗脫梯度進(jìn)行了考察。

3.4 樣品測(cè)定 不同批次蜜炙款冬花蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.047% ～0.278%之間，金絲桃苷在0.014%～0.109%之間，槲皮素在0.002% ～0.012%之間，山柰酚在0.001% ～0.019%之間。其中第11批 (產(chǎn)地河南)和第12批 (產(chǎn)地河南)黃酮類成分含有量較高，質(zhì)量較好?？疃ń?jīng)蜜炙后，蘆丁和金絲桃苷質(zhì)量濃度降低，槲皮素和山柰酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大。

采用HPLC法同時(shí)測(cè)定蜜炙款冬花中4種黃酮的含有量，方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，可以用于蜜炙款冬花的質(zhì)量控制。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)．中國(guó)植物志:第七十七卷［M］．北京:科學(xué)出版社，1999:93-94．

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［4］張 燕，黃 芳，吳 笛．款冬花及其所含生物堿對(duì)小鼠肝臟毒性作用的研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(8):1810-1811．

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