雙波長HPLC法同時測定茱苓草中馬錢苷酸和龍膽苦苷

崔春利， 王繼濤， 王 敏， 劉文中， 唐志書， 郭東艷

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712046;2.陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西咸陽712000;3.浙江工業(yè)大學(xué)，浙江杭州310014)

茱苓草，系龍膽科龍膽屬植物秦嶺龍膽Gentiana apiata N．E．Br．的全草，為秦巴山區(qū)特有的藥用植物資源，其味苦，性平，入肝、大腸、膀胱三經(jīng)，具有調(diào)經(jīng)活血，清熱明目，利小便之功，用于治療頭昏、失眠、小便不利、淋癥、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、崩漏、白帶、痢疾、腹痛等［1］。其主要化學(xué)成分有萜類，黃酮類，三萜，糖類及谷甾醇類等［2-3］，其中環(huán)烯醚萜和裂環(huán)環(huán)烯醚萜類為龍膽屬植物特征性成分，大多具有較強(qiáng)生理活性:馬錢苷酸有提高皮膚機(jī)能、促進(jìn)毛發(fā)生長、抑制中樞神經(jīng)、鎮(zhèn)痛和抗炎等作用;龍膽苦苷有促進(jìn)胃液分泌、抗原蟲和抗炎作用［4］。目前對于茱苓草的文獻(xiàn)報道較少，多是化學(xué)成分的研究，但關(guān)于茱苓草定量測定尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，本實(shí)驗結(jié)合文獻(xiàn)［5-10］報道方法，建立了雙波長HPLC法同時測定茱苓草中馬錢苷酸和龍膽苦苷，且對茱苓草全草和地上部分兩個部位進(jìn)行了比較，方法的準(zhǔn)確度與重復(fù)性考察均獲得較滿意的結(jié)果，適用于茱苓草中馬錢苷酸和龍膽苦苷的定量分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀 (美國Waters公司，Empower色譜工作站，Waters 2996 DAD);UV-2550紫外可見分光光度儀 (日本島津);BT 25S(十萬分之一)電子天平 (北京賽多利斯儀器有限公司);KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器 (昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 馬錢苷酸及龍膽苦苷對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號分別為111865-201001、110770-201013;純度分別為90.9%、96.9%，供定量測定用);茱苓草全草藥材2010年7月采自太白鰲山、市售茱苓草地上部分藥材購自太白縣藥材收購門市部 (均由陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤高級實(shí)驗師鑒定為龍膽科龍膽屬植物秦嶺龍膽Gentiana apiata N．E．Br．);甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Hypersil GOLD aQ C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);以甲醇-0.1%磷酸溶液 (20∶80)為流動相;體積流量為1 mL/min;柱溫為30℃;檢測波長為233 nm與272 nm。在此色譜條件下，馬錢苷酸和龍膽苦苷均與樣品中其他組分色譜峰基線分離，見圖1。按馬錢苷酸峰計算，理論板數(shù)為4 595，按龍膽苦苷峰計算，理論板數(shù)為9 648。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 對照品溶液的制備及測定波長選擇 精密稱取馬錢苷酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.166 mg的溶液;精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.219 mg的溶液。分別以所配制馬錢苷酸和龍膽苦苷對照品溶液為母液，經(jīng)適宜稀釋，以甲醇為溶劑空白，采用UV-2550于紫外200～400 nm下進(jìn)行掃描，結(jié)果馬錢苷酸λmax=233 nm，龍膽苦苷λmax=272 nm，故采用233 nm和272 nm為檢測波長。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.24 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理 (功率100 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過 (0.45 μm)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性范圍的考察 分別進(jìn)樣馬錢苷酸對照品溶液和龍膽苦苷對照品溶液 3、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件注入色譜儀，記錄峰面積，分別以馬錢苷酸、龍膽苦苷峰面積對進(jìn)樣量 (μg)回歸，得馬錢苷酸回歸方程為:A=596 496.102 1 C－10 277.941 18，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，馬錢苷酸在0.498～3.32 μg線性關(guān)系良好。龍膽苦苷回歸方程為:A=1 882 505.81C－85 636.286 51，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9，龍膽苦苷在0.657～4.38 μg線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，各5 μL，記錄峰面積，結(jié)果馬錢苷酸RSD為0.15%，龍膽苦苷RSD為0.12%，表明本試驗儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 稱取本品適量，按供試品制備方法制備供試液，分別于0、4、8 h進(jìn)樣5 μL測定峰面積，結(jié)果馬錢苷酸RSD為1.50%，龍膽苦苷RSD為0.75%。表明本品在8 h穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取茱苓草藥材5份，按供試品制備方法制成供試液，依法測定，馬錢苷酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.40%，RSD為0.69%。龍膽苦苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.92%，RSD為2.98%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取一定量已知含有量的樣品(馬錢苷酸與龍膽苦苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為:24.556 1 mg/g、19.688 4 mg/g)精密加入適量對照品，依法制備供試液，測定含有量并計算回收率，結(jié)果見表1和表2。

表1 馬錢苷酸的加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests of loganic acid(n=6)

表2 龍膽苦苷的加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests of gentiopicroside(n=6)

2.9 樣品測定 取茱苓草全草粗粉0.24 g與其地上部分粗粉3.0 g，各6批，按供試品制備方法制備樣品，依上述色譜條件測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果 (n=6)Tab.3 Results of contents determination of samples

3 討論

本研究通過紫外掃描確定馬錢苷酸λmax為233 nm，龍膽苦苷λmax為272 nm，因而采用233 nm、272 nm雙波長HPLC同步檢測技術(shù)對茱苓草中馬錢苷酸與龍膽苦苷進(jìn)行測定，方法科學(xué)，又極大簡化了色譜分離檢測步驟，提高了實(shí)驗效率。一般高效液相色譜—可變波長紫外檢測器系統(tǒng)均能實(shí)現(xiàn)，具有普遍適用性。最重要是，可以克服 (固定波長)單波長254 nm［11］同時檢測這2個成分檢測靈敏度較低的缺陷。

流動相系統(tǒng)的選擇中，鑒于2010年版《中國藥典》一部秦艽含量測定項中流動相采用乙腈-0.1%醋酸溶液［11］，考慮到系統(tǒng)0.1%醋酸溶液相對0.1%磷酸溶液有紫外本底吸收，同時鑒于醋酸具有揮發(fā)性，可隨時間造成流動相pH緩慢改變，故最終選擇0.1%磷酸溶液作為色譜系統(tǒng)的流動相。

從樣品測定結(jié)果，茱苓草全草與茱苓草地上部分2個藥材部位含有量差異懸殊，無論馬錢苷酸還是龍膽苦苷，推測其所含有的這2種環(huán)烯醚萜苷類成分主要集中于其根部，提示以全草入藥為好。

與茱苓草同屬的龍膽藥材 (Gentianae Radix et Rhizoma)，系龍膽科植物龍膽 (Gentianae scabra Bge．)的根及根莖，臨床主要以其干燥根和根莖入藥。李文龍［12］對全國6個不同產(chǎn)地的龍膽藥材中龍膽苦苷和馬錢子苷酸含有量進(jìn)行了比較研究，將其結(jié)果與本實(shí)驗茱苓草含有量比較，可以看出陜西太白山特有這個種的茱苓草的全草中馬錢苷酸量高出龍膽藥材6個產(chǎn)地中任一產(chǎn)地，而龍膽苦苷含有量略低于其6個產(chǎn)地的平均值，顯而易見，龍膽屬這2個不同種的藥材中環(huán)烯醚萜苷成分差異明顯，提示兩者的藥理效應(yīng)可能存在差異，那么今后有待對茱苓草藥理效應(yīng)進(jìn)一步研究。

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