痛經(jīng)康口服液對痛經(jīng)大鼠子宮組織中催產(chǎn)素受體及加壓素受體mRNA的表達(dá)的影響

趙偉國， 李運(yùn)景， 黃 民

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006;2.中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東中山528403)

痛經(jīng)康口服液是元胡、當(dāng)歸、川芎、香附等十二味中藥組成的純中藥復(fù)方制劑，來源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，是中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院制劑室開發(fā)的新的中藥復(fù)方制劑，具有理氣活血、通絡(luò)止痛的功效，主要用于治療多種原因引起的痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等病癥。前期研究［1］表明本品具有較高的安全性和明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用。為明確本品的抗痛經(jīng)作用及相關(guān)機(jī)制，本次研究采用實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)大鼠模型，觀察痛經(jīng)康口服液抗痛經(jīng)作用，并進(jìn)一步揭示并探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品及試劑 痛經(jīng)康口服溶液2.9 g生藥/mL及1.45 g生藥/mL(批號:20101108)，中山市人民醫(yī)院自制;己烯雌酚注射液 (批號:100104)，上海通用藥業(yè)股份有限公司;縮宮素注射液 (批號:0911262)，河南輔仁懷慶堂制藥有限公司;市售對照品 (治療對照)田七痛經(jīng)膠囊 (批號:N08009、N11026)，廣州敬修堂 (藥業(yè))股份有限公司;cDNA試劑盒 (Fermentas公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司)，三氯甲烷 (純度 ＞99.8%)(美國Sigma公司)，DL2000 DNA Maker(博大泰克)，Agarose LE(MDBio，Inc.西班牙)，TaqDNA聚合酶 (上海申能博彩生物科技有限公司)，EB(廣州威佳科技有限公司)Tris(The Dow Chemical Company)，Na2EDTA·2H2O(MBCHEM)，冰醋酸 (廣州化學(xué)試劑廠)，DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)(美國Sigma公司)，催產(chǎn)素受體 (OTR)，加壓素受體(VPR)，β-actin引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠，60只，雌性，150～170 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證明編號0075806。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BS—3000A電子天平 (上海友聲衡器有限公司生產(chǎn)，感量0.1 g);臺式離心機(jī)(德國Hettich，型號:Mikr020);UV7504型單光束紫外可見分光光度計(jì) (上海欣茂儀器有限公司);低溫高速離心機(jī) (長沙平凡儀器儀表有限公司);CU420型電熱恒溫水箱 (上海一恒科技有限公司);酶標(biāo)儀 TECAN TYPE:Sunrise Remote/TonchScreen(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司，DG5033A型);LX—100手掌型離心機(jī)(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，WO—9413B型凝膠成像系統(tǒng) (北京六一儀器廠)，Hema3200基因擴(kuò)增儀 (珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，POWER BC數(shù)控電泳儀 (上海申能博彩生物科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 劑量設(shè)計(jì)與分組

2.1.1 分組 正常對照組和模型對照組、田七痛經(jīng)膠囊組、痛經(jīng)康高、中、低劑量組，每組10只。

2.1.2 劑量設(shè)計(jì) 根據(jù)人服用劑量為50 mL/次(1.45 g生藥/mL)，每天2次，得大鼠每天等效劑量為 ［50 mL×2/60 kg］×6.5=10.83 mL/kg(按每人60 kg體質(zhì)量計(jì)算)。痛經(jīng)康低、中、高劑量組為大鼠等效劑量的0.5倍、1倍及2倍，得痛經(jīng)康低、中、高劑量組劑量分別為 7.85、15.70、31.41 g/(kg·d);田七痛經(jīng)膠囊組劑量為2 g/kg。

2.2 造模及給藥［2］除正常對照組外，各組大鼠股部皮下注射己烯雌酚，1次/d，連續(xù)11 d，其中第1天及第11天注射量為0.8 mg/只，第2天至第10天注射量為0.4 mg/只。皮下注射己烯雌酚的同時(shí)，正常對照組、模型對照組、田七痛經(jīng)膠囊組、痛經(jīng)康高、中、低劑量組大鼠按照1 mL/100 g灌胃給藥，痛經(jīng)康高、中、低劑量組給予相應(yīng)質(zhì)量濃度的痛經(jīng)康口服溶液，田七痛經(jīng)膠囊組給予0.2 g/mL田七痛經(jīng)膠囊溶液，劑量為2 g/(kg·d)，正常對照組及模型對照組給予等量的生理鹽水，連續(xù)給藥11 d。于最后1次給藥40 min后，所有大鼠按體質(zhì)量4 U/kg腹腔注射縮宮素致大鼠扭體反應(yīng)。

2.3 觀察及指標(biāo)檢測

2.3.1 基本情況觀察 從實(shí)驗(yàn)開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每天觀察并記錄大鼠的日常情況1次。給藥第11天，于腹腔注射縮宮素后觀察大鼠扭體反應(yīng)發(fā)生的潛伏期、30 min內(nèi)的扭體反應(yīng)次數(shù)和扭體動物數(shù)。扭體反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn):大鼠腹部收縮內(nèi)凹，軀干與后肢伸展，臀部與一側(cè)肢體內(nèi)旋。體質(zhì)量:實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束各稱大鼠體質(zhì)量1次。

2.3.2 標(biāo)本采集及檢測 測完扭體反應(yīng)后1 h，按40 mg/kg體質(zhì)量對大鼠進(jìn)行戊巴比妥鈉麻醉，分離腹主動脈，無菌采血約5 mL，分2份，1份置于肝素抗凝管后離心取血漿-80℃保存，另1份置于無抗凝管中，離心取血清-80℃保存待測。放血處死解剖取子宮組織，分2份，一份置于-80℃保存;另一份子宮組織置于4%多聚甲醛保存待用。

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體見表1。

表1 引物合成序列Tab.1 Primer sequence

取凍存子宮組織100 mg按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取1 μL cDNA依次加 入 10 × buffer 2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、10 μmol/L Primer 0.5 μL，Taq 酶 0.25 μL，ddH2O 19.25 μL，分別進(jìn)入PCR循環(huán)。循環(huán)條件:95℃預(yù)變性5 min、94℃變性0.5 min，退火 (催產(chǎn)素受體54℃、加壓素受體58.5℃、β-actin 57.2℃)0.5 min，72℃延伸1 min。催產(chǎn)素受體、加壓素受體、β-actin共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)終末72℃10 min終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物10 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳條帶結(jié)果采用凝膠圖像分析儀分析，計(jì)算目的產(chǎn)物與β-actin的OD比值，作為表達(dá)的半定量指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 基本觀察 各個(gè)試驗(yàn)過程中，各給藥大鼠在給藥后被毛光亮，精神活動、大小便等均未見異常，口、眼、耳、鼻均未見異常分泌物。體質(zhì)量:給藥結(jié)束時(shí)模型對照組體質(zhì)量較實(shí)驗(yàn)開始時(shí)略有減輕，與正常對照組比較明顯減輕 (P＜0.01);其他各給藥組體質(zhì)量均較前增長，田七痛經(jīng)膠囊組與痛經(jīng)康低劑量組體質(zhì)量較模型對照組明顯增長 (P＜0.01)。結(jié)果見表2。

表2 對痛經(jīng)模型大鼠體質(zhì)量的影響 (±s)Tab.2 Comparison of weight in rats(±s)

表2 對痛經(jīng)模型大鼠體質(zhì)量的影響 (±s)Tab.2 Comparison of weight in rats(±s)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01。

/g正常對照組組別 樣本數(shù)劑量/(g·kg-1)實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體質(zhì)量/g實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量10 - 188.3±5.2 221.8±6.8模型對照組 10 - 186.2±8.7 183.3±15.5##田七痛經(jīng)膠囊組 10 2.0 191.2±5.2 203.0±9.2＊＊痛經(jīng)康低劑量組 9 7.85 190.7±8.2 206.8±10.9＊＊痛經(jīng)康中劑量組 10 15.7 185.2±9.3 190.1±10.5痛經(jīng)康高劑量組10 31.41 186.3±12.0 197.4±13.4

3.2 扭體反應(yīng) 正常對照組10只大鼠未見出現(xiàn)扭體反應(yīng)，其余各給藥組均出現(xiàn)不同程度的扭體反應(yīng)。痛經(jīng)康低、中、高劑量組出現(xiàn)扭體反應(yīng)的動物數(shù)量均較模型對照組減少，且呈劑量依賴關(guān)系。田七痛經(jīng)膠囊組、痛經(jīng)康中、高劑量組出現(xiàn)扭體反應(yīng)潛伏期較模型對照組延長，30 min扭體反應(yīng)次數(shù)較模型對照組減少，其中痛經(jīng)康中劑量組與模型對照組比較扭體反應(yīng)潛伏期明顯延長 (P＜0.01)，但扭體反應(yīng)次數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表3。

3.3 子宮組織催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達(dá)與正常組比較，模型對照組痛經(jīng)大鼠子宮催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達(dá)顯著增高 (P＜0.01)，而田七痛經(jīng)膠囊組、痛經(jīng)康低、中、高劑量組可不同程度降低痛經(jīng)大鼠子宮催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達(dá) (P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)果見表4，圖1，圖2。

表3 對大鼠痛經(jīng)模型扭體反應(yīng)的影響 (±s)Tab.3 Comparison of the writhing response in dysmenorrhea model rats(±s)

表3 對大鼠痛經(jīng)模型扭體反應(yīng)的影響 (±s)Tab.3 Comparison of the writhing response in dysmenorrhea model rats(±s)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，＊＊P＜0.01。

/%正常對照組組別 樣本數(shù) 劑量/(g·kg-1) 扭體潛伏期/min 30 min扭體次數(shù) 扭體動物數(shù)/只 扭體百分率10 - 00模型對照組 10 - 11.26±4.65## 10.23±10.28## 8 80.0##田七痛經(jīng)膠囊組 10 2.0 12.24±5.03 5.88±5.33 8 80.0痛經(jīng)康低劑量組 9 7.85 7.26±1.93 14.25±6.50 7 77.8痛經(jīng)康中劑量組 10 15.7 19.42±6.50＊＊ 4.00±4.47 6 60.0痛經(jīng)康高劑量組10 31.41 14.50±4.32 5.00±5.39 4 40.0

表4 對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織催產(chǎn)素受體及加壓素受體mRNA表達(dá)的影響 (±s)Tab.4 The mRNA expression levels of OTR and VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats(±s)

表4 對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織催產(chǎn)素受體及加壓素受體mRNA表達(dá)的影響 (±s)Tab.4 The mRNA expression levels of OTR and VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats(±s)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

-actin正常對照組組別 樣本數(shù) 劑量/(g·kg-1)OTR mRNA/β-actin VPR mRNA/β 10 - 0.528±0.144 0.544±0.212模型對照組 10 - 0.798±0.139## 0.923±0.169##田七痛經(jīng)膠囊組 10 2.0 0.648±0.161* 0.720±0.190*痛經(jīng)康低劑量組 9 7.85 0.650±0.161* 0.744±0.181*痛經(jīng)康中劑量組 10 15.7 0.627±0.156* 0.650±0.180＊＊痛經(jīng)康高劑量組 10 31.41 0.641±0.138* 0.678±0.148＊＊

圖1 催產(chǎn)素受體mRNA表達(dá)Fig.1 The mRNA expression levels of OTR in the uteruine of dysmenorrhea model rats

圖2 加壓素受體mRNA表達(dá)Fig.2 The mRNA expression levels of VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats

4 討論

原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但有大量研究顯示原發(fā)性痛經(jīng)與多種原因有關(guān)，主要和前列腺素 (PG)有關(guān)［3］，其次催產(chǎn)素與加壓素也是痛經(jīng)發(fā)生兩個(gè)重要致病因素。催產(chǎn)素不僅可直接作用于子宮肌細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)生化途徑引起子宮收縮，同時(shí)還能激活磷酸肌醇循環(huán)，調(diào)節(jié)局部前列腺素的產(chǎn)生，引起并加重痛經(jīng)［4］。催產(chǎn)素能刺激PGF2α的合成與釋放，PGF2α能增加催產(chǎn)素的釋放而不影響其合成，兩者具有協(xié)同作用，共同導(dǎo)致子宮收縮［5］。催產(chǎn)素作用于平滑肌細(xì)胞的催產(chǎn)素受體升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+，直接刺激其收縮，而催產(chǎn)素與內(nèi)膜催產(chǎn)素受體結(jié)合后，誘導(dǎo)內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生PGF2α，以旁分泌方式刺激平滑肌收縮［6］。研究表明隨著痛經(jīng)婦女在月經(jīng)早期激素水平的升高，加壓素成為子宮平滑肌的活動增加子宮血流減少的一個(gè)重要因素［7］。正常情況下排卵期血漿中血管加壓素水平最高，黃體期下降直至月經(jīng)期。原發(fā)性痛經(jīng)婦女晚黃體期雌激素水平異常升高，所以在月經(jīng)期第一天血管加壓素水平高于正常人2～5倍［8］。痛經(jīng)患者對血管加壓素的敏感性較高，加壓素主要通過作用于子宮加壓素受體，引起子宮肌層及動脈壁平滑肌收縮加強(qiáng)，使子宮血流減少，從而引起子宮局部缺血，疼痛加劇。加壓素也能通過促進(jìn)前列腺素生成和增加子宮平滑肌對縮宮藥物的敏感性，減少子宮血運(yùn)而致痛經(jīng)。并且催產(chǎn)素受體和加壓素還具有部分交叉作用［9］。應(yīng)用催產(chǎn)素及加壓素拮抗劑阿托西班及SR 49059［10］時(shí)可以緩解痛經(jīng)的癥狀，這都說明催產(chǎn)素及加壓素參與了痛經(jīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示大鼠經(jīng)注射己烯雌酚，催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達(dá)升高，對催產(chǎn)素反應(yīng)敏感性增強(qiáng)。預(yù)防性用藥后產(chǎn)生明顯的抗痛經(jīng)作用，這可能與痛經(jīng)康低、中、高劑量組不同程度降低痛經(jīng)大鼠子宮催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達(dá)，降低對催產(chǎn)素反應(yīng)敏感性有關(guān)。

痛經(jīng)屬中醫(yī)“經(jīng)行腹痛”范疇，主要是由于婦女在行經(jīng)期間受到致病因素的影響，導(dǎo)致沖任郁阻或寒凝經(jīng)脈，使氣血運(yùn)行不暢，胞宮經(jīng)血流通受阻，以致不通則痛;或沖任、胞宮失于濡養(yǎng)，不榮則痛［11］。有研究表明［12］，原發(fā)性痛經(jīng)的主要中醫(yī)證型為氣滯血瘀證、寒凝血瘀證、肝郁氣滯證、肝腎虧損證、氣血虛弱證等，其中以氣滯血瘀證為最多。氣滯血瘀證因多抑郁，復(fù)傷情志，肝郁則氣滯，氣滯則血滯，以致血海氣機(jī)不行，經(jīng)血運(yùn)行不暢，發(fā)為痛經(jīng)。痛經(jīng)康口服液原方由紅花、桃仁、元胡、當(dāng)歸、川芎、香附等十二味中藥組成，來源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有理氣活血、通絡(luò)止痛的功效，主治中醫(yī)辨證氣滯血瘀之痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等病。方中紅花善通利經(jīng)脈，為血中氣藥［13］994，桃仁為血瘀血閉之專藥［13］1789。二者相須為用活血通經(jīng)、化瘀止痛。元胡能理氣活血、調(diào)經(jīng)止痛，辛散溫通，為活血行氣止痛之良藥［14］803。當(dāng)歸補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，為血中之氣藥［13］879。川芎性善散，又走肝經(jīng)，氣中之血藥［13］222。丹參活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，善治血分，去滯生新，調(diào)經(jīng)順脈［13］482。香附為氣病之總司，女科之主帥［14］890，可疏肝理氣，調(diào)經(jīng)止痛，為調(diào)理沖任氣血之要藥。川楝子主入肝經(jīng)，疏泄肝熱，行氣止痛。本方以紅花、桃仁、元胡為君藥，當(dāng)歸、川芎、丹參加強(qiáng)活血止痛之效，香附、川楝子加強(qiáng)理氣止痛之效，共為臣藥。佐以白芍、蒲黃、五靈脂，諸藥相合共奏活血通經(jīng)、理氣止痛之效，從而使胞宮氣血運(yùn)行通暢而達(dá)通則不痛之功。

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