針對Abl-T315I突變的Bcr-Abl蛋白激酶抑制劑的研究進(jìn)展

李婉貞，薛曉文

中國藥科大學(xué) 藥物化學(xué)教研室，南京 210009

隨著2001年美國FDA批準(zhǔn)的第一個治療慢性粒細(xì)胞白血病 （chronic myelocytic leukemia，CML）的 Bcr-Abl（Abelson proto-oncogene/breakpoint cluster region）酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼的出現(xiàn)，尋找小分子化合物抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶以治療CML逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。然而，隨著臨床應(yīng)用的增加，部分患者對伊馬替尼產(chǎn)生了耐藥性。伊馬替尼耐藥性的產(chǎn)生主要與Bcr-Abl激酶的突變有關(guān)，目前已證實(shí)的Bcr-Abl突變有15種，包括Y253H、E255V、E255K、F359V、T315I等在內(nèi)，其中以T315I在突變中占的比重最大，達(dá)20%的耐藥程度，且耐藥程度最高。T315I突變直接影響與伊馬替尼的結(jié)合，而不顯著影響與ATP的結(jié)合。該突變主要是由較大的疏水性的異亮氨酸 （Ile）替代了Abl激酶315位的蘇氨酸（Thr）造成的，它消除了抑制劑與激酶高親和力的結(jié)合所需要的氫鍵，并且在空間上阻礙伊馬替尼與ATP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合[1]。為克服伊馬替尼的耐藥問題，新的、更為強(qiáng)效的第二代TKI達(dá)沙替尼（Dasatinib）和尼羅替尼（Nilotinib）應(yīng)運(yùn)而生，這兩種藥物能克服大部分突變產(chǎn)生的耐藥性，但仍不能有效抑制T315I突變。隨后開發(fā)的一系列藥物如伯舒替尼（Bosutinib）、巴菲替尼（Bafetinib）、塞卡替尼（Saracatinib）等也都對該突變束手無策[2]。更糟糕的是，如果患者反復(fù)使用達(dá)沙替尼和尼羅替尼等第二代TKI，T315I突變所占的比例會進(jìn)一步增加。因此，開發(fā)針對T315I突變有效的TKI已迫在眉睫。本文擬就目前正在開發(fā)中的對T315I突變具有抑制活性的Bcr-Abl蛋白激酶抑制劑進(jìn)行綜述。

1 ATP競爭性抑制劑

1.1 VX-680（MK-0457）（1）

VX-680（MK-0457）是由默克公司（Merck）和維泰士公司（Vertex）共同研發(fā)的一種小分子極光激酶、JAK-2以及FLT3（fms-related tyrosine kinase 3）的多重抑制劑，能夠阻斷細(xì)胞周期而引起不同類型的腫瘤細(xì)胞的凋亡。令人欣喜的是，VX-680與Bcr-Abl活性部位連接后不僅能抑制野生型Bcr-Abl的活性，還具有抗T315I突變的活性[3]。這種抑制劑是目前報道的第一種對T315I突變有臨床活性的激酶抑制劑，已經(jīng)進(jìn)入伊馬替尼耐藥性的CML和ph+ALL（費(fèi)城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血?。┑?期臨床研究中。

VX-680對Abl-T315突變體的半數(shù)抑制濃度（IC50）為30 nmol·L-1。對其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，VX-680與極光激酶A（Aurora-A）的鉸鏈區(qū)結(jié)合后形成一個疏水口袋，這個疏水口袋能夠與Bcr-Abl和伊馬替尼耐受的突變株結(jié)合。這個模型也許能夠解釋VX-680能夠同時抑制Aurora-A、Abl和Abl-T315I突變的原因[4]。

1期和2期臨床研究表明，VX-680給藥后，3例有伊馬替尼耐藥性和T315I突變的病人出現(xiàn)了血液學(xué)反應(yīng)，并且沒有顯著的髓外毒性，其中兩例病人的突變體克隆的濃度也下降了。當(dāng)VX-680與達(dá)沙替尼聯(lián)合用藥時，能夠降低T315I突變以及其他突變發(fā)生的概率，并且提高達(dá)沙替尼的治療效果和持續(xù)時間[4]。

令人遺憾的是，在2期臨床研究中，一位患者的心電圖在給藥后發(fā)生改變，這導(dǎo)致Vertex公司終止了該化合物的研發(fā)，但它新穎的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計策略卻為針對T315I抑制劑的開發(fā)提供了有益的啟示。

1.2 Ponatinib（2，AP24534）

Ponatinib是Ariad公司研發(fā)的口服多種激酶抑制劑，能夠抑制Bcr-Abl、Flt3和Src激酶的活性。它對大多數(shù)Bcr-Abl突變株有抑制作用，包括T315I突變株，目前已進(jìn)入2期臨床研究階段。其對野生型 Abl激酶和 Abl-T315I突變株的 IC50分別為0.37、2.0 nmol·L-1[5]。

與第二代Bcr-Abl激酶抑制劑不同的是，在體外誘變篩選實(shí)驗(yàn)中，Ponatinib沒有引起新的突變。1期試驗(yàn)結(jié)果表明，在2年試驗(yàn)期中，Ponatinib的MCR率（主要細(xì)胞遺傳學(xué)緩解率）都持久穩(wěn)定。92%的有T315I突變的患者取得了顯著細(xì)胞遺傳學(xué)緩解率（MCyR），即費(fèi)城染色體降至35%或更少。對于沒有T315I突變的患者，MCyR率在一年期達(dá)到了61%。對于在先前接受了至少2種以上TKIs治療后均以失敗告終的Ph+CML患者，在服用Ponatinib 后有50%獲得完全的血液學(xué)反應(yīng)。重要的是，隨著時間的推移，Ponatinib能夠持久地緩解病情，并且提高緩解程度。對于有T315I突變的患者來說，這種藥是一種突破。

1.3 達(dá)努塞替（3，Danusertib，PHA-739358）

達(dá)努塞替是由Nerviano Medical Sciences公司研發(fā)的1，4，5，6-四氫吡咯 [3，4-c]吡唑類似物，是Aurora激酶A和B的ATP-競爭性抑制劑[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)它能夠抑制Bcr-Abl激酶的活性，并且對T315I突變株也有效。

達(dá)努塞替在廣泛的人Bcr-Abl陽性與陰性細(xì)胞中表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗增殖與促凋亡的作用 （IC50=25 nmol·L-1），并且能抑制鼠Ba/F3細(xì)胞中異位表達(dá)野生型或伊馬替尼耐藥的Bcr-Abl突變，包括T315I（IC50為0.12 μmol·L-1）。它能夠抑制產(chǎn)生Ph染色體的K562白血病細(xì)胞的活性，并且能夠抑制位于Abl激酶的活性環(huán)區(qū)域的Tyr412的磷酸化作用。在白血病細(xì)胞株，包括對伊馬替尼耐藥的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)伊馬替尼與達(dá)努塞替具有藥理學(xué)的協(xié)同作用[5]。目前，該藥正在進(jìn)行對伊馬替尼耐受和具有Abl-T315I突變的CML患者的2期臨床研究[18]。

1.4 BO1（4）

該化合物是在研究1,3,4-噻二唑類誘導(dǎo)藥時，通過對數(shù)據(jù)庫內(nèi)藥效團(tuán)的分子對接及分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)的。研究表明BO1在抑制Abl激酶活性表現(xiàn)出高度的潛力。在對于伊馬替尼敏感的和耐受的白血病細(xì)胞中都顯示出一定的生物活性 （LD50=2.2 μmol·L-1）[8]。它對Abl的抑制能力是Src的5倍。

體外實(shí)驗(yàn)表明，化合物BO1對T315I突變株表現(xiàn)出明顯的抑制作用，它對T315I突變株的抑制能力是野生型Abl的4倍。

該類化合物以游離酶為靶標(biāo)，在與游離酶形成酶-抑制劑復(fù)合物之后，ATP和肽都不能再與相應(yīng)的酶相結(jié)合。對于Abl激酶的情況，其取代位置更為復(fù)雜，BO1同時以游離酶以及酶-肽復(fù)合物為靶點(diǎn)，阻止ATP的結(jié)合[9]。對于野生型Abl，它是個ATP競爭性抑制劑，但當(dāng)作用于T315I突變株時，表現(xiàn)為非競爭性抑制劑。

2 非ATP競爭性抑制劑

2.1 ON-012380（5）

ON-012380是由Onconova Therapeutics研發(fā)的非ATP競爭型抑制劑，與伊馬替尼不同，ON-012380阻斷底物結(jié)合位點(diǎn)，而不是ATP結(jié)合位點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)表明，ON-012380既能抑制野生型ABL激酶，也能抑制所有伊馬替尼耐藥突變的激酶。不僅如此，ON-012380還能抑制血小板衍生生長因子受體（PDGFR）激酶和Src家族的Lyn，但對干細(xì)胞因子受體（c-kit）的抑制作用很弱。目前該藥還未進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

ON-012380能夠特異性抑制Bcr-Abl，并且體外實(shí)驗(yàn)表明，在濃度小于10 nmol·L-1時即可引導(dǎo)表達(dá)T315I突變體的Ph+CML細(xì)胞的凋亡。它能夠顯著地抑制Bcr-Abl的自磷酸化和作為底物的調(diào)節(jié)蛋白Crk的磷酸化 （IC50=9 nmol·L-1），是伊馬替尼的10倍以上（IC50=100 nmol·L-1），并且不管是在體內(nèi)還是體外該化合物抑制T315I突變的活性是伊馬替尼的10000倍，對T315I重組蛋白的IC50為1.38 nmol·L-1（伊瑪替尼幾乎無活性）[10]。當(dāng)它與伊馬替尼同時給藥時，對抑制Bcr-Abl能夠發(fā)生協(xié)同作用，說明兩者與Bcr-Abl在不同的部位結(jié)合，這也進(jìn)一步證實(shí)了ON-012380是個非ATP競爭型抑制劑。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，對裸鼠腹腔注射100 mg·kg-1，能夠顯著地抑制T315I白細(xì)胞的增長。嚙齒類動物對ON-012380的耐受性良好，連續(xù)三周以上每天服用濃度超過100 mg·kg-1也沒有引起血液中毒[10]。

2.2 GNF-2（6）

GNF-2是在尋找能夠靶向性結(jié)合Abl激酶中除與ATP結(jié)合位點(diǎn)以外的其他部位，從而達(dá)到抑制Abl激酶活性的過程中發(fā)現(xiàn)的。它可以不直接抑制Abl激酶區(qū)域，卻能高效選擇性地抑制Abl和Bcr-Abl（IC50=0.14 μmol·L-1）轉(zhuǎn)變細(xì)胞[11]，是非ATP競爭性抑制劑。最新研究表明，在Abl激酶域的C端存在一個肉豆蔻結(jié)合口袋，GNF-2通過與其結(jié)合使得非活性構(gòu)象的Abl結(jié)構(gòu)被夾住而處于穩(wěn)定狀態(tài)[12]。

在小鼠模型中，當(dāng)GNF-2/GNF-5與ATP競爭性抑制劑同時作用于Bcr-Abl時，能夠顯著地減少突變發(fā)生的幾率，并且能夠同時抑制野生型和T315I突變的Bcr-Abl激酶活性[13]。

2.3 DCC-2036（7）

DCC-2036是由Deciphera Pharmaceuticals研發(fā)的，有望治療那些對標(biāo)準(zhǔn)治療發(fā)生抵抗且很少有其他治療選擇的白血病患者。研究發(fā)現(xiàn)，藥物DCC-2036在小鼠模型中可抗擊CML，且對人類白血病細(xì)胞有效。這些結(jié)果表明，DCC-2036是一種用于臨床研發(fā)治療CML的良好候選藥。目前，DCC-2036正在那些應(yīng)用兩種其他TKIs無效的患者中進(jìn)行1期臨床試驗(yàn)[5]。

DCC-2036能有效抑制磷酸化和非磷酸化狀態(tài)下的Abl活性（IC50=0.8 nmol·L-1），通過非ATP競爭機(jī)制，避免與Ile315位阻沖突，同時還能誘導(dǎo)Ba/F3細(xì)胞的凋亡。該細(xì)胞能表達(dá)多種與Bcr-AblTKI耐藥相關(guān)的突變株，包括T315I，許多突變的P-環(huán)，達(dá)沙替尼耐藥的突變F317L等。DCC-2036對Abl、FLT3、TIE2基因和Src家族激酶具有高度選擇性，對Abl-T315I的IC50為4 nmol·L-1。在100 mg·kg-1· day-1灌胃給藥時，顯著延長患有由野生型Bcr-Abl和T315I逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病，如延長骨髓增生性疾病的小鼠的生存時間[6]。

由此可見，Bcr-Abl激酶的非ATP競爭性抑制劑也是個戰(zhàn)略性的研究方向。

3 其 他

另有文獻(xiàn)報道一些TKI，如Doramapimod（8，BIRB-796）[14]，Aurora A抑制劑 AT-9283（9）和SGX-70430[5，14]等也具有抑制T315I突變的活性，但這些化合物與Bcl-Abl激酶的作用機(jī)制還未見報道。其中SGX-70430的結(jié)構(gòu)還未見文獻(xiàn)報道。

Doramapimod（8）是德國勃林格殷格翰公司研發(fā)的一種新型腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抑制劑，主要用于TNF-α水平升高所引發(fā)的一些炎性疾病的治療。最新研究表明，Doramapimod能夠抑制伊馬替尼耐藥的Abl-T315I突變。它與Abl-T315I結(jié)合緊密，其親合常數(shù)Kd=40 nmol·L-1，但是與野生型Bcl-Abl和其他類型的伊馬替尼耐藥的突變株的結(jié)合力要弱得多，Kd＞1 μmol·L-1[15]。

AT-9283（9），是由Astex Therapeutics公司研發(fā)的一種Aurora抑制劑，有文獻(xiàn)報道稱其具有抑制野生型Bcl-Abl和T315I突變的活性，目前該藥物正在進(jìn)行針對固體瘤以及包括CML在內(nèi)的血液病的1期臨床研究中，其給藥方式為每星期一次，連續(xù)靜脈注射24小時[16]。

SGX-70430是由美國SGX醫(yī)藥品公司采用FASTTM法開發(fā)出的對野生型Bcl-Abl和4種常見突變（包括T315I）均有效的化合物。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其抑制Ba/F3突變細(xì)胞株T315I和M351T細(xì)胞增殖的半數(shù)有效濃度 （EC50）分別為21 nmol·L-1和15 nmol·L-1，明顯低于伊馬替尼。SGX-70430目前正在進(jìn)行1期臨床研究。

4 展 望

對伊馬替尼耐藥的Bcr-Abl突變體生物學(xué)結(jié)構(gòu)的認(rèn)知，使得Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑的研發(fā)進(jìn)入了一個新的階段。由于T315I突變能引起高水平（＞100倍）的伊馬替尼抵抗，因而針對該突變研究新型有效的抑制劑將具有巨大的藥理學(xué)意義。雖然目前還沒有抗T315I突變的激酶抑制劑上市，但已有多個這樣的抑制劑進(jìn)入臨床研究[2，17-18]。開發(fā)能抑制T315I突變的新穎高效Bcr-Abl抑制劑，并且在聯(lián)合用藥方面作進(jìn)一步探索，將是治療慢性粒細(xì)胞白血病的方向。

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