茵陳蒿湯HPLC指紋圖譜初步研究*

楊愛華，竇志華，羅 琳，葛建華，孟 萍

1南京中醫(yī)藥大學，南京 210046；2南通大學附屬南通第三醫(yī)院，南通 226006；3南通大學，南通 226001；4南通市藥品檢驗所，南通 226006

茵陳蒿湯出自漢代張仲景所著《傷寒論》，由茵陳、大黃、梔子組成，具有清熱除濕、利膽退黃的功效，為中醫(yī)治療濕熱黃疸的第一要方?，F(xiàn)代研究結果表明，茵陳蒿湯不僅具有促進膽紅素代謝的作用，還具有抗肝損傷、抑制肝細胞凋亡、抑制星狀細胞活化等作用[1]，有著廣闊的應用前景。多年來，茵陳蒿湯的藥效物質基礎研究一直是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的熱點之一，但是以往的研究過分強調單一成分的作用。眾所周知，中藥復方的作用特點是多成分、多靶點的整體調節(jié)。指紋圖譜技術能較好地解決如何表征中藥復方的整體性和復雜性，其包含的不同性質的各類化學成分可通過一張或多張指紋圖譜得以表達。這些化學成分的整體情況，包括其所含的物質數(shù)、物質量和組成比例差異，都會對功效產生影響。專家指出，應該將中藥指紋圖譜中化學成分的變化與中藥藥效結果聯(lián)系起來，建立中藥“譜（組）效學”研究體系[2]。本實驗對茵陳蒿湯指紋圖譜進行初步研究，為下一步譜效關系分析奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀 （配四元泵、脫氣裝置、自動進樣器、DAD紫外檢測器），HP ChemSation工作站 （美國Agilent公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng) （法國Millipore公司）；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮）；BOLONG-USC502超聲清洗器（上海波龍電子設備有限公司）；Sartorius BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試劑

乙腈、甲醇（色譜純，德國Merk公司）；其余試劑均為分析純；水為自制重蒸餾水。

1.3 對照品與藥品

沒食子酸、綠原酸、梔子苷、大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚（均購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為：110831-200302、110753-200413、110749-200613、110756-200110、110796-200615、0757-200206、110795-200806、758-9904）；茵陳（產地陜西）購自江蘇眾益康醫(yī)藥有限公司，梔子（批號0802002）購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，大黃購自甘肅禮縣春天藥業(yè)有限公司，經(jīng)南通藥品檢驗所龔旭東主任中藥師鑒定，以上中藥飲片的原植物來源分別為菊科濱蒿、茜草科梔子和蓼科掌葉大黃。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

圖1 對照品（A）、大黃（B）、茵陳蒿湯（C）及茵陳+梔子（D）HPLC色譜圖

2.1.1 茵陳蒿湯供試品溶液的制備 稱取茵陳粗粉22.5 g、梔子粗粉15 g、大黃粗粉7.5 g，加純化水煎煮3次 （14倍量30 min，10倍量30 min，7倍量20 min），合并水提液，過濾，旋轉蒸發(fā)儀濃縮至約50 mL，加乙醇使含醇量為60%，4000 r·min-1離心10 min，上清液移置250 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，取5.5 mL置25 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，即得。進樣前用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過。

2.1.2 大黃供試品溶液的制備 取大黃粗粉7.5 g，按“2.1.1”方法制備大黃溶液。

2.1.3 茵陳+梔子供試品溶液的制備 取茵陳粗粉22.5 g、梔子粗粉15 g，按“2.1.1”方法制備茵陳+梔子溶液。

2.1.4 對照品溶液的制備 精密稱取大黃素2.73 mg、大黃酚2.82 mg、大黃酸2.30 mg、蘆薈大黃素3.13 mg、大黃素甲醚2.85 mg、沒食子酸3.04 mg、綠原酸3.73 mg、梔子苷3.02 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件考察

2.2.1 流動相的選擇 比較乙腈-0.1%磷酸和甲醇-1%醋酸作為流動相的分離效果，結果表明，同一條件下乙腈較甲醇對茵陳蒿湯的分離效果較佳。因此，選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動相。

2.2.2 檢測波長的選擇 吸取茵陳蒿湯供試品溶液10 μL進樣測定，對254 nm、280 nm及440 nm波長下的色譜圖進行分析比較。結果表明，在254 nm下出峰最豐富，其他波長下未見新成分色譜峰，因此選定254 nm為指紋圖譜測定波長。

2.2.3 柱溫的選擇 同一條件下考察柱溫對各峰的影響，結果以30℃為佳。

2.2.4 流動相的優(yōu)化 吸取茵陳蒿湯供試品溶液10 μL進樣，流速1.0 mL·min-1，比較乙腈（A）-0.1%磷酸（B）系統(tǒng)3種不同梯度變化程序，結果表明，（梯度程序為：0～5 min，5%A；5～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A；30～50 min，15%～20%A；50～ 65 min，20%～25%A；65～75 min，25%～35%A；75～85 min，35%～50%A；85～95 min，50%～85%A；95～100 min，85%～90%A；100～110 min，90%A；110～115 min，90%～5%A；115～120 min，5%A）在254 nm波長下色譜峰分離情況較好。

2.2.5 運行時間的確定 考察了上述選定條件下120 min色譜圖，發(fā)現(xiàn)105 min后無特征峰出現(xiàn)，故將分析時間定為110 min。

根據(jù)以上試驗結果，最終確定以下色譜條件：welch-materials XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫 （程序見“2.2.4”）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；運行時間：110 min；進樣量：10 μL。

2.3 部分共有峰鑒定及歸屬分析

分別取對照品溶液、大黃供試品溶液、茵陳蒿湯供試品溶液及茵陳+梔子供試品溶液各10 μL，按“2.2”項的考察選定的色譜條件分別進樣測定。比較茵陳蒿湯、大黃及茵陳+梔子色譜圖，對共有峰進行初步歸屬分析。見圖1。

由圖1可知：（1）初步建立的茵陳蒿湯指紋圖譜有8個成分得到鑒定：沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚來源于大黃；綠原酸和梔子苷來源于茵陳、梔子。（2）指紋圖譜保留時間在40～50 min及70 min以后共有峰主要來源于大黃；保留時間在0～30 min及50～60 min共有峰主要來源于茵陳和梔子。而保留時間在60～70 min共有峰既來自大黃也來自茵陳和梔子。

3 討 論

本次試驗的茵陳蒿湯供試品溶液取自茵陳蒿湯制劑水煎原液的60%乙醇上清液部分，主要原因是因為藥效試驗結果表明，茵陳蒿湯保肝利膽作用的藥效物質主要是存在于水煎原液的60%乙醇上清液部分，該上清液部分的指紋圖譜，也為以后從譜效關系角度深入研究茵陳蒿湯藥效物質基礎奠定了基礎。

本課題組前期研究建立了HPLC法測定茵陳蒿湯中綠原酸、梔子苷及5種蒽醌類成分的方法[3-4]，研究同時表明，茵陳蒿湯中大黃所含成分與其他兩味藥茵陳、梔子的色譜行為差異較大，故本試驗將全方拆分成大黃及茵陳與梔子兩部分制備供試品進樣檢測，從本次試驗結果看，茵陳蒿湯所含化學成分可以通過一張指紋圖譜來表達。

[1] 徐國萍，白 娟，舒靜娜，等.茵陳蒿湯藥理研究進展[J].浙江中西醫(yī)結合雜志，2011，21（1）：64-7.

[2] 賀福元，鄧凱文，羅杰英，等.中藥譜效學研究方向初探[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2004，6（6）：44-50.

[3] 葛建華，竇志華，羅 琳，等.HPLC法測定茵陳蒿湯中綠原酸和梔子苷的含量 [J].江蘇中醫(yī)藥，2009，41（1）：56-7.

[4] 葛建華，竇志華，羅 琳，等.高效液相色譜法測定茵陳蒿湯中5種蒽醌類成分的含量 [J].中國醫(yī)院藥學雜志，2009，29（7）：590-2.