京尼平苷透皮制劑抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究*

施華平，張 杰，游偉良，曹 維，孫敏捷**

1南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南京 210046；2中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，南京 211198；3國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作江蘇中心，蘇州 215011

梔子（fructus gardeniae）是茜草科植物山梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于浙江、福建、江西、湖南、廣東，其性寒味苦，歸心肺三焦經(jīng)，具有泄火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效[1]。梔子中起到抗炎、活血化瘀作用的有效成分主要為京尼平苷，但對(duì)其研究較少，與之形成強(qiáng)烈對(duì)比的是，已報(bào)道的梔子相關(guān)自制制劑治療軟組織損傷的病例多達(dá)幾千例，足見其療效的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。梔子果中梔子苷（geniposide）含量很高（含量可達(dá)6%），在梔子的藥用效果中起重要作用[2]。京尼平苷是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷 （化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），有報(bào)道其具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[3-4]，但是到目前為止，尚未見梔子的有效成分為基礎(chǔ)的外用制劑的上市報(bào)道。京尼平苷在活血化瘀、消炎止痛方面制成透皮制劑能提高患者的順應(yīng)性。本文用梔子的有效成分京尼平苷制備經(jīng)皮滲透制劑，即制備京尼平苷乳膏和微乳，然后進(jìn)行鎮(zhèn)痛和抗炎作用研究，為梔子的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電子天平（北京賽多禮斯儀器系統(tǒng)有限公司）；恒溫震蕩儀（國(guó)華電器有限公司）；熱板測(cè)痛儀GJ-8402型（寧海白石電子醫(yī)藥儀器廠）；鼠耳打孔器；千分尺。

圖1 京尼平苷結(jié)構(gòu)式

1.2 材料

京尼平苷 （純度98%，深圳維琪生物有限公司）；皮炎平（復(fù)方醋酸地塞米松乳膏，三九醫(yī)藥股份有限公司）；扶他林（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，北京諾華制藥有限公司）；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯 （Solutol?HS 15）、聚氧乙烯醚40氫化蓖麻油（Cremorph RH 40，德國(guó)BASF有限公司，分析純）；二乙二醇單乙醚 （Transcutol P，法國(guó)Gattefosse公司，分析純）；單硬脂酸甘油酯（美國(guó)Eastman公司，分析純）；辛酸/癸酸甘油三酯（GTCC，廣州良吉化工有限公司，分析純）；肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、甘油、氮酮（Azone）、醋酸、二甲苯、乙腈、油酸（OA）、丙三醇、異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD小鼠，雌性或雌雄兼用，體重130～150 g；昆明種小鼠，雌性或雌雄兼用，體重18～22 g（浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2008-0033）。

2 方法與結(jié)果

2.1 透皮制劑的處方和工藝

2.1.1 乳膏的處方與工藝 處方：Cremophor RH 40 6%、單硬脂酸甘油酯6%、十八醇8%、辛酸癸酸甘油三酯2%、肉豆蔻酸異丙酯6%、油酸2%、甘油10%、氮酮3%、尼泊金乙酯0.3%、京尼平苷占0.5%，加去離子水至100%。

制備工藝 分別按處方量稱量油相（單硬脂酸甘油酯、十八醇、IPM、Cremophor RH 40、GTCC、OA、Azone、尼泊金乙酯）和水相（甘油、去離子水），分別置于燒杯中，使油相和水相在80℃水浴中保溫，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芑?，將水相緩緩倒入油相中，邊加邊勻速攪拌成乳膏狀，自然冷卻至溫度30℃以下停止攪拌。

乳膏的性質(zhì) 京尼平苷乳膏色澤均勻、質(zhì)地細(xì)膩、滲透性良好、便于涂布，含量為0.5%，穩(wěn)定性良好，能滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求。

2.1.2 微乳的處方與工藝 處方：Solutol?HS 15∶Transcutol P∶IPM∶京尼平苷水溶液（2∶1∶1∶6）。

制備工藝 將表面活性劑Solutol?HS 15與助表面活性劑按比例混合，然后加入油相IPM中，加熱攪拌30 min后，京尼平苷溶于適量水相中，把水相注入其中，攪拌形成澄清透明微乳。

微乳的性質(zhì) 微乳制劑中京尼平苷含量為0.5%，澄清透明符合要求，能滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 京尼平苷制劑的抗炎、鎮(zhèn)痛藥效研究

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)主要包括鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)和抗炎實(shí)驗(yàn)兩部分，以對(duì)應(yīng)臨床上的已知效用。分別選取已經(jīng)在市場(chǎng)上銷售，而且具有確切療效的皮炎平（內(nèi)含地塞米松）和扶他林（內(nèi)含雙氯芬酸二乙胺）兩種外用制劑進(jìn)行比較。以扶他林作為鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照藥物，以皮炎平作為抗炎實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照藥物。鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)[3-4]采用經(jīng)典的扭體法和熱板測(cè)痛法進(jìn)行考察；抗炎實(shí)驗(yàn)采用二甲苯致炎和角叉菜膠致腳趾腫脹進(jìn)行比較。

2.2.1 對(duì)醋酸致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用[4-5]參照文獻(xiàn)方法。取昆明種小鼠36只，隨機(jī)分成6組，每組6只。分別為空白組（不含任何基質(zhì)或者藥物）、乳膏基質(zhì)組（只含乳膏基質(zhì)）、京尼平苷乳膏組、京尼平苷微乳組、皮炎平乳膏組、扶他林乳膠劑組。根據(jù)人體常用推薦劑量（0.05 g/cm2），按體表面積折算出小鼠用量為0.03 g/cm2[6-7]。實(shí)驗(yàn)前24 h，用刀片剃去所有小鼠腹部面積約4 cm2的毛。給小鼠涂抹基質(zhì)或者藥物，每次0.12 g，1次/h，共4 h。各組于末次給藥30 min后，分別按0.1 mL/10 g體重腹腔注射0.6%的醋酸溶液，立即觀察并記錄15 min內(nèi)的扭體次數(shù)，計(jì)算鎮(zhèn)痛率。

結(jié)果如表1所示，扶他林乳膠劑組和京尼平苷乳膏組均能極顯著減少小鼠的15 min內(nèi)的扭體次數(shù)（P＜0.01），而空白基質(zhì)對(duì)照組小鼠的扭體次數(shù)與正常對(duì)照組比較無顯著性差異，表明京尼平苷乳膏能顯著抑制醋酸所致的小鼠疼痛，且其鎮(zhèn)痛作用是由藥物引起，而不是由乳膏基質(zhì)產(chǎn)生的。京尼平苷微乳可以抑制醋酸所致的疼痛，與空白組比較具有顯著性差異（P＜0.05），皮炎平對(duì)醋酸所致的小鼠扭體無明顯的抑制作用。

表1 對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響（±s，n＝6）

表1 對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響（±s，n＝6）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.2.2 熱板測(cè)痛法[4-5]參照文獻(xiàn)方法。取健康昆明種雌性小鼠，實(shí)驗(yàn)前于熱板測(cè)痛儀上測(cè)定痛閾值3次（以出現(xiàn)舔后足反應(yīng)為觀察指標(biāo)），挑選3次平均痛閾值在5～30 s內(nèi)的小鼠30只，隨機(jī)分為5組，每組6只。分別為乳膏空白基質(zhì)組、京尼平苷乳膏組、京尼平苷微乳組、皮炎平乳膏組、扶他林乳膠劑組。于小鼠后足涂藥，用藥量和用藥次數(shù)同“2.2.1”。各組末次給藥30 min后，分別測(cè)定并記錄小鼠痛閾值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果如表2所示，扶他林乳膠劑和京尼平苷乳膏均能顯著延長(zhǎng)小鼠的1 min內(nèi)的舔足時(shí)間，與基質(zhì)組比較有顯著性差異（P＜0.05），而基質(zhì)組小鼠的舔足時(shí)間差與正常對(duì)照組比較無顯著性差異，反而在給藥后，舔足時(shí)間有所減少，提示京尼平苷乳膏能顯著抑制醋酸所致的小鼠疼痛，且其鎮(zhèn)痛作用是由藥物引起，而不是由乳膏基質(zhì)產(chǎn)生的。京尼平苷微乳能夠提高小鼠的痛閾，但不具有顯著性差異，皮炎平對(duì)醋酸所致的小鼠扭體無明顯的抑制作用。

2.2.3 對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響[8]參照文獻(xiàn)方法。取昆明種小鼠36只，隨機(jī)將小鼠分成6組，每組6只。分別為空白組、乳膏基質(zhì)組、京尼平苷乳膏組、京尼平苷微乳組、皮炎平乳膏組、扶他林乳膠劑組。于小鼠兩耳雙面均勻涂賦形劑或受試藥物，用藥量和用藥次數(shù)同 “2.2.1”。末次給藥后30 min，用適當(dāng)方法去除空白基質(zhì)或受試藥物。各組小鼠于右耳正反兩面涂上二甲苯20 μL致炎，致炎后1 h脫頸椎處死，用直徑9 mm打孔器沖下左耳和右耳同一部位的圓片，于分析天平上稱重，以兩耳片重差值為炎癥腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表2 對(duì)熱刺激所致小鼠疼痛的影響，n＝6）

表2 對(duì)熱刺激所致小鼠疼痛的影響，n＝6）

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根據(jù)結(jié)果，如表3所示，皮炎平組和京尼平苷乳膏組均能顯著減少二甲苯致小鼠耳廓腫脹的程度（P＜0.05），而空白基質(zhì)對(duì)照組的二甲苯致小鼠耳廓腫脹的程度與正常對(duì)照組比較無顯著性差異，表明京尼平苷乳膏能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，且抗炎去腫作用是由藥物引起，而非乳膏基質(zhì)產(chǎn)生的。京尼平苷微乳對(duì)耳廓腫脹有一定抑制作用，但效果較京尼平苷乳膏差，和空白基質(zhì)組相比不具有顯著性差異，扶他林對(duì)二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹無明顯的抑制作用。

表3 對(duì)于二甲苯致小鼠耳腫脹的抗炎作用（±s，n＝6）

表3 對(duì)于二甲苯致小鼠耳腫脹的抗炎作用（±s，n＝6）

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2.2.4 對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響[8]參照文獻(xiàn)方法。取大鼠36只，隨機(jī)分成6組，每組6只。分別為空白組、乳膏基質(zhì)組、京尼平苷乳膏組、京尼平苷微乳組、皮炎平乳膏組、扶他林乳膠劑組。據(jù)人體常用推薦劑量（0.05 g·cm-2），按體表面積折算出大鼠的用量為0.05 g·cm-2[6-7]。在大鼠右后足涂抹基質(zhì)適量或受試藥物0.1 g，1次/h，共4 h。末次給藥后30 min，用千分尺測(cè)定每組大鼠右后足正常厚度后，立即于大鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜膠混懸液0.1 mL/只致炎，分別于致炎后1、2、4、6、8、12 h用千分尺測(cè)量大鼠右后足厚度，記錄最大腫脹度，計(jì)算各劑量組的腫脹抑制率。

結(jié)果如表4所示，皮炎平組和京尼平苷乳膏組均能顯著減少角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的程度，腫脹抑制率和空白基質(zhì)組有顯著性的差異 （P＜0.05），和抗炎藥扶他林接近，而基質(zhì)組的角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的程度與正常對(duì)照組比較無顯著性差異，表明京尼平苷乳膏能顯著抑制角叉菜膠所致的大鼠足跖腫脹，且抗炎作用是由藥物引起，而非基質(zhì)產(chǎn)生的。京尼平苷微乳可以顯著抑制大鼠的足跖腫脹，效果較乳膏劑為好。扶他林對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹無明顯的抑制作用。

表4 對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響n＝6）

表4 對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響n＝6）

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3 討 論

將京尼平苷制成乳膏和微乳以期能顯著改善京尼平苷的皮膚透過性，達(dá)到透皮療效。通過對(duì)京尼平苷經(jīng)皮制劑的抗炎鎮(zhèn)痛的藥效學(xué)研究表明，京尼平苷乳膏在抗炎鎮(zhèn)痛方面具有確切療效。在二甲苯致小鼠耳廓腫脹的實(shí)驗(yàn)中，作用強(qiáng)于市售皮炎平軟膏；在叉菜膠致大鼠足跖腫脹的實(shí)驗(yàn)中京尼平苷乳膏和微乳都表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗炎作用，并且和市售的皮炎平接近。炎癥部位的NO釋放增多是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要因素。而核因子-κB（NK-κB）的激活在由γ-干擾素（γ-IFN）刺激引起NO生成的過程中起關(guān)鍵作用。NK-κB的生成主要由IκBs的降解誘導(dǎo)的。京尼平苷作用機(jī)理相似于阿司匹林等非甾體類抗炎藥，抑制了內(nèi)源性介質(zhì)如5-羥色胺、組胺、緩激肽和前列腺素等的釋放，能顯著抑制γ-IFN引起IκB降解，可通過直接抑制NK-κB發(fā)揮抗炎作用，也可通過抑制進(jìn)一步抑制誘導(dǎo)型NO合酶表達(dá)和合成，而間接達(dá)到抗炎目的[5]。

京尼平苷微乳也有一定的鎮(zhèn)痛的作用，采用經(jīng)典的扭體法和熱板測(cè)痛法進(jìn)行考察，京尼平苷乳膏和微乳都表現(xiàn)了一定鎮(zhèn)痛效果，京尼平苷微乳鎮(zhèn)痛效果較乳膏劑差，原因可能是微乳流動(dòng)性強(qiáng)，不易黏著于局部皮膚上，造成藥物損失。京尼平苷乳膏鎮(zhèn)痛效果與市售的扶他林接近。醋酸引起的小鼠腹膜疼痛和急性炎癥，是通過間接引起內(nèi)源性介質(zhì)如：5-羥色胺、組胺、緩激肽和前列腺素等的釋放，刺激與非甾體抗炎藥敏感的痛覺神經(jīng)，被認(rèn)為是非選擇性疼痛模型，有文獻(xiàn)研究證明，京尼平苷阻止了前列腺素的釋放[9]，達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。

京尼平苷具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，將其制備成透皮制劑，使其更好地到達(dá)作用部位，但是由于微乳和乳膏的一些差異，京尼平苷乳膏更易黏著于局部皮膚上，能更好地透皮吸收達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛作用。

通過不同的致炎和致痛實(shí)驗(yàn)，表明京尼平苷乳膏對(duì)動(dòng)物具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，能達(dá)到市售的抗炎和鎮(zhèn)痛藥的效果，在臨床用藥中更方便有效。京尼平苷透皮利劑的鎮(zhèn)痛抗炎作用是確切有效的。

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