加替沙星原位凝膠的體外釋放及兔眼房水藥動(dòng)學(xué)研究*

韓 培，李 娟

中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009

加替沙星（Gatifloxacin，GTX）是第4代6-氟-8-甲氧基喹諾酮類(lèi)抗菌藥物[1]，其滴眼液存在角膜前滯留時(shí)間過(guò)短、生物利用度低等問(wèn)題，而其凝膠劑粘度過(guò)大，給藥不方便。原位凝膠這一新劑型近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，其形成機(jī)制是利用高分子材料對(duì)外界刺激的響應(yīng)，使聚合物在生理?xiàng)l件下發(fā)生分散狀態(tài)或構(gòu)象的可逆變化，由溶液向半固體凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)化[2]，以實(shí)現(xiàn)液態(tài)給藥、在體形成凝膠，從而延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。

溫敏基質(zhì)泊洛沙姆407溶液的膠凝溫度較低，需在低溫下貯存，將其與泊洛沙姆188等聯(lián)合使用，則可以提高體系的膠凝溫度[3]。本文制備了加替沙星溫度敏感型及改性海藻酸鈉離子敏感型兩種凝膠，以滴眼液的形式滴入眼穹窿，在眼部膠凝，形成粘彈性膠體，大大改善了以上問(wèn)題，并對(duì)其體外釋藥特性與機(jī)制以及家兔房水中的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

紫外分光光度計(jì) （上海菁華科技儀器有限公司）；恒溫振蕩器（金壇市精達(dá)儀器制造廠）；島津Shimadzu LC-1-AD高效液相色譜儀；Shimadzu SPD-10A紫外檢測(cè)器；N2000色譜工作站。

1.2 試藥與試劑

加替沙星（純度99.99%，江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）；環(huán)丙沙星（浙江京新藥業(yè)有限公司）；加替沙星滴眼液（規(guī)格：5 mL∶15 mg，江蘇云陽(yáng)集團(tuán)藥業(yè)有限公司）；泊洛沙姆407及泊洛沙姆188（德國(guó)BASF公司）；高G單元海藻酸鈉 （藥用級(jí)，F(xiàn)MC公司）；HPMCK4M（上?？?lè)康包衣技術(shù)有限公司）；乙腈為色譜純；其它試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康家兔若干，無(wú)眼疾，♀♂各半，體重2.4 kg左右（南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 加替沙星溫度敏感型原位凝膠的制備

將加替沙星（3 mg·mL-1）置于適量水中，使其完全溶解；加入處方量的泊洛沙姆407及188，室溫?cái)嚢韬笾糜诒渲?；待其充分溶脹后，加?.01%的抑菌劑苯扎氯銨。另取處方量的HPMC，加入適量水，迅速攪拌使充分水合，與上述溶液混勻，用0.1 mol· L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4并加水至總量，待體系充分溶脹分散形成澄明的溶液即得。

2.2 加替沙星離子敏感型原位凝膠的制備

采用高碘酸鈉氧化法，使海藻酸鈉結(jié)構(gòu)中糖醛酸順二醇碳碳鍵斷裂形成雙醛結(jié)構(gòu)[4]，得到生物降解性能良好的改性海藻酸鈉，以此為基質(zhì)制備離子敏感型凝膠。制備方法同“2.1”。

2.3 加替沙星的含量測(cè)定[5]

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用模擬人工淚液配制成4.0～14.0 μg·mL-1的加替沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，在293 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值，以A對(duì)質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.0564C+0.0058（r=0.9999），表明加替沙星在該濃度范圍內(nèi)吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度與回收率考察 精確配制加替沙星4.0、8.0、12.0 μg·mL-1三個(gè)濃度溶液，考察日內(nèi)及日間精密度；按處方比例配制凝膠空白基質(zhì)，加入加替沙星，使基質(zhì)中藥物含量分別為80%、100%、120%，測(cè)定回收率。結(jié)果RSD均＜2%，且溫敏與離子敏感型基質(zhì)的回收率均在98%～102%之間，符合方法學(xué)要求（n=3）。

2.4 體外釋藥實(shí)驗(yàn)

采用無(wú)膜溶出法[6]。將適量樣品加入已稱(chēng)重的具塞刻度試管中，稱(chēng)重，（35±0.5）℃恒溫水浴振蕩器中放置10 min，加入2.4 mL釋放介質(zhì)（模擬人工淚液，35°C），在一定頻率下恒溫振蕩，每隔20 min取出釋放介質(zhì)，濾紙迅速吸干試管表面，稱(chēng)重，再放回振蕩器中，平衡10 min，補(bǔ)充新鮮釋放介質(zhì)，重復(fù)操作至剩余凝膠少于10%，相鄰時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量差異即為凝膠溶蝕量。將每次取出的溶液置5 mL量瓶中放冷，釋放介質(zhì)定容、搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，測(cè)定藥物含量。

分別以凝膠累積溶蝕量及藥物累積釋放量對(duì)時(shí)間作圖，得到凝膠經(jīng)時(shí)溶蝕曲線及藥物經(jīng)時(shí)釋放曲線。以不同時(shí)間點(diǎn)的累積百分溶蝕率對(duì)累積百分釋放率作圖，得凝膠溶蝕與藥物釋放相關(guān)性曲線。

2.4.1 釋放面積及振蕩頻率對(duì)凝膠溶蝕和藥物釋放的影響 眼部給藥后凝膠受到眨眼剪切作用鋪展于角膜表面，其鋪展?fàn)顟B(tài)決定了凝膠與淚液的接觸面積。取三種橫截面積 （即釋放面積）分別為0.79、1.33、4.52 cm2的不同規(guī)格具塞試管，振蕩頻率為100 r·min-1，模擬眼部釋放面積對(duì)凝膠溶蝕和藥物釋放的影響。

凝膠在眼部還受眨眼頻率的影響，可用振蕩頻率來(lái)模擬眨眼的頻率，考察振蕩頻率分別為50、100、150 r·min-1時(shí)對(duì)凝膠溶蝕和藥物釋放的影響。

圖1 釋放面積對(duì)溫敏型凝膠溶蝕（A）與藥物釋放（B）和離子敏感型凝膠溶蝕（C）與藥物釋放（D）的影響（n=3）

由圖1、圖2可知，隨釋放面積從0.79 cm2增至4.52 cm2或振蕩頻率從50 r·min-1增至150 r·min-1，溫敏及離子敏感型凝膠溶蝕速率和釋藥速率均相應(yīng)增大，且與時(shí)間呈良好線性關(guān)系，呈零級(jí)動(dòng)力學(xué)；同一釋放面積或振蕩頻率下，離子敏感型凝膠溶蝕及藥物釋放均明顯快于溫敏型凝膠；改變釋放面積或振蕩頻率不影響凝膠溶蝕及藥物釋放動(dòng)力學(xué)特征。

2.4.2 藥物釋放與凝膠溶蝕的相關(guān)性考察 分別將不同釋放面積、不同振蕩頻率下的藥物累積釋放百分率對(duì)凝膠累積溶蝕百分率進(jìn)行線性回歸，結(jié)果均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系；其中釋放面積為1.33 cm2、振蕩頻率為100 r·min-1時(shí)，線性回歸方程的斜率最接近于1，且溫敏型凝膠的線性略?xún)?yōu)于離子敏感型凝膠，兩者的回歸方程分別為：Y=0.9239X-0.0503，r=0.9995；Y=0.8682X-0.0888，r=0.9994。

圖2 振蕩頻率對(duì)溫敏型凝膠溶蝕（A）與藥物釋放（B）和離子敏感型凝膠溶蝕（C）與藥物釋放（D）的影響（n=3）

綜上，在不同的釋放面積或振蕩頻率下，凝膠溶蝕及藥物釋放速率均不相同，凝膠溶蝕與藥物釋放具有相關(guān)性，可見(jiàn)凝膠溶蝕是決定藥物釋放的主要因素。通過(guò)體外釋藥實(shí)驗(yàn)可以預(yù)測(cè)藥物在眼部的吸收情況，眨眼使凝膠鋪展于角膜表面，而鋪展?fàn)顟B(tài)及眨眼頻率的不同都會(huì)對(duì)藥物釋放產(chǎn)生影響，隨著凝膠的溶蝕，藥物不斷釋放出來(lái)作用于眼部。mL-1）的加替沙星房水樣本，于1 d內(nèi)的不同時(shí)間和不同的日間分別進(jìn)樣（n=3），測(cè)定日內(nèi)精密度RSD分別為0.33%、0.85%、0.29%，日間精密度RSD分別為0.29%、1.6%、0.53%；計(jì)算回收率分別為99.67%、100.72%、99.96%，RSD分別為1.43%、0.26%、0.55%。2.5.5 給藥及樣品采集 實(shí)驗(yàn)組為加替沙星溫敏型凝膠及離子敏感型凝膠，對(duì)照組為市售普通滴眼液。將加替沙星凝膠劑及滴眼液3組制劑隨機(jī)分配家兔，每組制劑4只兔子，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括2只兔眼的數(shù)據(jù)。分別于清醒家兔結(jié)膜囊內(nèi)給予上述制劑各50 μL，強(qiáng)制閉眼20 s。于給藥后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8 h耳緣靜脈注射20%烏拉坦麻醉家兔，純化水沖洗眼表，立即用1 mL無(wú)菌注射器從角膜緣上方刺入前房，抽取房水適量，按“2.5.2”項(xiàng)下方法處理樣品，立即用HPLC法檢測(cè)。

2.5.6 數(shù)據(jù)的處理 根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)，作出房水中藥物濃度-時(shí)間曲線圖，采用DAS1.0藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行模型分析和擬合，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)用t檢驗(yàn)判斷差異性，以P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的顯著性水平。

由圖3可知，凝膠最初以液態(tài)與角膜表面接觸，藥物迅速釋放，因此前0.25 h內(nèi)房水藥物濃度接近滴眼液水平；繼而形成凝膠，使藥物的角膜滯留能力得到改善，在以后每個(gè)取樣點(diǎn)均顯著高于滴眼液對(duì)照組，且溫敏凝膠的達(dá)峰時(shí)間推遲至2.0 h。由表1數(shù)據(jù)看出，凝膠組與滴眼液組各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)作t檢驗(yàn)判斷，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.5 加替沙星凝膠制劑的房水藥動(dòng)學(xué)研究

2.5.1 色譜條件[7]色譜柱：Kromasil C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為KH2PO4溶液 （用磷酸調(diào)pH值4.0）-乙腈（80∶20，v/v）；柱溫40°C；檢測(cè)波長(zhǎng)為293 nm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。

2.5.2 房水的處理 將抽取的200 μL房水置于離心管中，渦旋振蕩混勻30 s，以10000 r·min-1離心10 min，取上清液150 μL備用。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用甲醇作溶劑，配制質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg· mL-1含內(nèi)標(biāo)（1.0 μg·mL-1）的加替沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取100 μL于50°C氮?dú)饬飨麓蹈桑?00 μL房水復(fù)溶，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以加替沙星濃度為橫坐標(biāo)，加替沙星與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，線性回歸得方程為：Y=1.9076X-0.0394（r=0.9998），加替沙星在0.05～10.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.4 精密度與回收率實(shí)驗(yàn) 取空白房水500 μL、加替沙星儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.05、1.0、10.0 μg·mL-1的低、中、高3種濃度含內(nèi)標(biāo)（1.0 μg·

圖3 加替沙星凝膠組及滴眼液組給藥后在家兔房水中的藥-時(shí)曲線（n=3）

表1 凝膠組及滴眼液組家兔房水中加替沙星的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=3

表1 凝膠組及滴眼液組家兔房水中加替沙星的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=3

P＜0.05，*P＜0.01 vs eye drops

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3 討 論

加替沙星口服吸收迅速、組織分布廣、消除半衰期長(zhǎng)且不良反應(yīng)少，受到醫(yī)藥界的青睞。本文成功制備了兩種加替沙星原位凝膠，溫敏型凝膠在26°C下呈液態(tài)，在眼部35°C溫度條件下可快速膠凝；而離子敏感型凝膠劑滴入眼部遇Ca2+幾乎立即形成半固態(tài)凝膠，其特點(diǎn)延長(zhǎng)了藥物在眼表的滯留時(shí)間、使用方便、與角膜親和力強(qiáng)、給藥劑量準(zhǔn)確。

采用無(wú)膜溶出模型以模擬眼部環(huán)境，對(duì)制劑進(jìn)行體外釋放評(píng)價(jià)。結(jié)果藥物隨著凝膠溶蝕而恒速釋放出來(lái)，溫敏型凝膠的溶蝕及藥物釋放比離子敏感型緩慢，緩釋效果更明顯。房水藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明，凝膠與滴眼液相比，房水中的藥物濃度明顯提高，作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)，其中溫敏型凝膠的達(dá)峰時(shí)間推遲至2.0 h，溫敏及離子敏感型凝膠藥-時(shí)曲線下面積AUC0-8h分別約為滴眼液的4.35和3.49倍。可見(jiàn)，體內(nèi)外研究結(jié)果一致，具有一定的相關(guān)性。

綜上，加替沙星原位凝膠具有緩控釋能力，可延長(zhǎng)藥物在眼部的作用時(shí)間，提高生物利用度，改善患者順應(yīng)性，具有很好的發(fā)展前景。

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