油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究進展＊

涂世偉， 郭萬里， 蔣立希， 潘建偉

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004;2.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院作物科學研究所，浙江杭州 310012)

油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究進展＊

涂世偉1， 郭萬里2， 蔣立希2， 潘建偉1

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004;2.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院作物科學研究所，浙江杭州 310012)

主要對油菜外植體類型、篩選標記、轉(zhuǎn)化方法、作物改良及其成果進行了綜述，并對轉(zhuǎn)基因油菜存在的問題和前景進行了探討.研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)階段油菜轉(zhuǎn)基因仍存在局限性，主要表現(xiàn)在：1)轉(zhuǎn)化受體再生周期長，轉(zhuǎn)化過程繁瑣，轉(zhuǎn)化效率低;2)外源基因表達不確定，遺傳不穩(wěn)定，基因沉默現(xiàn)象有待解決;3)轉(zhuǎn)基因油菜對人類健康和生態(tài)環(huán)境可能存在不利影響及不確定性的風險，應進行科學評估，且需建立更完善的相關法律法規(guī).同時，應繼續(xù)發(fā)展及利用油菜轉(zhuǎn)基因以滿足人們的需求，特別是利用油菜生產(chǎn)能源替代品——生物柴油，前景廣闊.

油菜;遺傳轉(zhuǎn)化;外植體;篩選標記;轉(zhuǎn)化方法

1 外植體

外植體是用來進行遺傳轉(zhuǎn)化的離體受體組織.外植體的選取是實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件之一，適宜的外植體應具備取材方便、再生能力強、遺傳穩(wěn)定等特點.不同的外植體對于油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立具有很大的差異.1989年，Moloney等［2］首次以子葉柄為外植體成功地將NPTⅡ?qū)胗筒酥?，發(fā)現(xiàn)甘藍型油菜子葉柄末端切口處的薄壁細胞不但再生能力強(80%)，且易被農(nóng)桿菌感染和轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化率為55%.近些年，國內(nèi)外以油菜子葉柄為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化已有大量的報道.Maheshwari等［3］優(yōu)化了子葉柄的轉(zhuǎn)化體系，使其適用于多個油菜品種，得到了較高的轉(zhuǎn)化率.下胚軸也是常用的外植體.文獻［4］以油菜下胚軸為外植體，在愈傷誘導期增加7 d的預培養(yǎng)，使再生芽出芽期提前7 d，且芽的再生率高達96.67%.Fry等［5］建立了莖段遺傳轉(zhuǎn)化體系.Burbulis等［6］分別以莖段和下胚軸為外植體，研究了不同油菜品種的再生，發(fā)現(xiàn)一些品種莖段再生率較下胚軸高25.78% ～85.11%.Dutta 等［7］以油菜葉片為外植體，成功建立了5個油菜栽培品種的基因轉(zhuǎn)化體系.段英姿等［8］認為：以子葉柄、下胚軸為受體，具有操作簡單、快速且轉(zhuǎn)化率高(1.5%～55%)等優(yōu)點，但再生植株易為嵌合體，基因型也可能是雜合的;以原生質(zhì)體為受體則能得到高度純合體，但存在原生質(zhì)體制備復雜、分化難、再生和轉(zhuǎn)化率低等缺點.本實驗室選用子葉柄和下胚軸為外植體建立了油菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系，發(fā)現(xiàn)3～5 d苗齡子葉柄和4～6 d下胚軸再生能力最強，取材方便，易分化，下胚軸再生芽的數(shù)量比子葉柄多，但下胚軸外植體易褐化且再生苗假陽性高，而子葉柄轉(zhuǎn)化率高，再生時間更短.

自Licther［9］首次報道在甘藍型油菜中進行游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株后，小孢子培養(yǎng)技術被廣泛應用于油菜轉(zhuǎn)基因.Abdollahi等［10］利用基因槍技術及小孢子培養(yǎng)技術進行油菜基因轉(zhuǎn)化，獲得大量的轉(zhuǎn)化苗.由于小孢子本身具有單細胞性和單倍性的雙重特點，用它作為轉(zhuǎn)化受體進行外源基因?qū)?，不僅有利于基因表達，還可以加速轉(zhuǎn)基因材料的純合，從而大大縮短育種年限.至今，通過小孢子培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因油菜的技術日益成熟，該技術在法國、加拿大等油菜主產(chǎn)國已成為一種常規(guī)育種技術.

2 篩選標記

篩選標記的選擇在油菜遺傳轉(zhuǎn)化中非常重要，使用頻率最高的是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPTⅡ)、二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、乙?；D(zhuǎn)移酶基因(Bar)和鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Spt).Schroder等［11］研究了 4種選擇標記基因(NPTⅡ，aadA，Bar和Spt)在甘藍型油菜轉(zhuǎn)化過程中的篩選效果，發(fā)現(xiàn)用aadA(介導對鏈霉素和壯觀霉素的抗性)作為篩選標記的效果最好.文獻［12］以aroA-M1突變基因為篩選標記，在含草甘膦的培養(yǎng)基中篩選到轉(zhuǎn)基因苗.Wallbraun等［13］以磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(PMI)為篩選標記，證明甘露糖能有效篩選轉(zhuǎn)基因植株.本實驗室使用潮霉素與卡那霉素作為篩選標記，發(fā)現(xiàn)潮霉素篩選對外植體再生影響不大，篩選效果很好，而卡那霉素則容易使再生苗發(fā)白，很難得到抗性苗.

3 轉(zhuǎn)化方法

隨著轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展，用于外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法越來越多，大體可分成2類：一是農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化法;另一是外源基因直接導入法，如基因槍法、PEG介導法、電擊法、激光微束穿刺法、顯微注射法和花粉管通道法.

3.1 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法

農(nóng)桿菌(Agrobacterium)是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，有根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizobium)，能夠在植物的受傷部位侵染植物細胞，將T-DNA轉(zhuǎn)入植物細胞并整合進植物的基因組，并在植物體內(nèi)表達外源基因.目前，農(nóng)桿菌介導法在轉(zhuǎn)基因技術中使用頻率最高，是最普遍的油菜轉(zhuǎn)化方法.因為農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因方法具備以下優(yōu)點：不需要專門儀器;宿主范圍廣，包括大多數(shù)雙子葉植物和單子葉植物;插入外源基因的片段較大，可達50 kb以上;轉(zhuǎn)化率明顯高于其他直接轉(zhuǎn)化方法;外源基因整合到植物基因組上的拷貝數(shù)較少，多為單拷貝;整合的外源基因變異小，后代的分離也遵循孟德爾遺傳定律.缺點是受宿主范圍和菌株特異性等因素的限制［14］.

根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌均已成功用于轉(zhuǎn)化油菜.Metz等［15］和 Henzi等［16］用發(fā)根農(nóng)桿菌介導白菜型油菜的轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)得到的轉(zhuǎn)化苗出現(xiàn)不正常的表型，如頂端優(yōu)勢下降、葉片起皺、花畸形和可育性下降.根癌農(nóng)桿菌是現(xiàn)在最理想的遺傳轉(zhuǎn)化媒介，但仍有以發(fā)根農(nóng)桿菌介導油菜品質(zhì)改良的報道.Higgins等［17］利用發(fā)根農(nóng)根菌成功地將1-氨基環(huán)丙烷基-1-羧酸(ACC)合成酶基因及氧化酶基因?qū)胗筒耍D(zhuǎn)基因植株表型正常.

農(nóng)桿菌介導的花序浸泡(Floral-dip)轉(zhuǎn)化方法是近年發(fā)展起來的一種簡便、快速、高效、重復性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因體系，它是由真空滲透(Vacuum Infiltration in Planta)轉(zhuǎn)化法簡化而來，只需將植株的花序浸泡在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中幾min，然后等種子成熟后即可通過篩選得到轉(zhuǎn)基因的種子.付紹紅等［18］用花序浸泡法處理甘藍型油菜得到了103株卡那霉素抗性植株.文獻［19］將此方法進行了改良，在轉(zhuǎn)基因植株收到種子后，用100 mg/L潮霉素浸泡種子24～36 h，再種于蛭石中，一周后即可篩選出轉(zhuǎn)基因植株.文獻［20］報道通過花絮浸泡法將擬南芥中克隆的赤霉素2-氧化酶基因(AtGA2ox8)導入甘藍型油菜，轉(zhuǎn)基因植株表型矮小、主枝增多、莢果變多，且轉(zhuǎn)化株的逆境耐性增強.農(nóng)桿菌介導的花序浸泡轉(zhuǎn)基因法比農(nóng)桿菌介導的組培法具有新的優(yōu)勢：1)不需建立煩瑣費時的組織培養(yǎng)再生體系，大大簡化實驗操作，并且可使沒有建立再生體系的植物實現(xiàn)外源基因的導入;2)不需要依賴精密儀器和昂貴藥品，在人力、物力、財力上投入更小;3)在短期內(nèi)可以得到大量的轉(zhuǎn)基因植株，且減少變異株的發(fā)生機率［21］.然而，該方法的作用機理目前還不是很清楚，并且還只局限于少數(shù)植物，其應用的有效性有待于進一步深入研究.

文獻［22］利用超聲波輔助含目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化油菜萌發(fā)種子，通過β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色實驗和巢式PCR驗證，獲得轉(zhuǎn)基因植株.對該方法的報道較少，有待進一步重復實驗.

3.2 DNA直接導入法

3.2.1 基因槍法

基因槍法是繼農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法之后又一應用十分廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術，它是通過高壓將包被外源DNA的微小金?；蜴u粒高速射入受體細胞或組織，使外源DNA進入植物細胞并整合到植物染色體組中，從而達到穩(wěn)定遺傳和表達的目的.基因槍法最早是由Sanford等［23］提出的，目前在水稻、小麥、玉米、油菜等十幾種植物中均有應用.在國內(nèi)，侯丙凱等［24］通過基因槍法將蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因(Bt)轉(zhuǎn)入油菜，在國際上首次實現(xiàn)了抗蟲基因?qū)τ筒巳~綠體基因組的定點整合.文獻［25］利用基因槍法轉(zhuǎn)化油菜子葉柄葉綠體基因組，對T1代轉(zhuǎn)基因植株分析發(fā)現(xiàn)，整合的葉綠體基因組其遺傳率約為8%，表明油菜可能是一種適合葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的作物.文獻［10］也有關于基因槍技術用于油菜遺傳轉(zhuǎn)化的報道.

3.2.2 PEG 介導法

聚乙二醇(PEG)介導法由 Krens等［26］首先建立，其主要原理是借助細胞融合劑誘導原生質(zhì)體攝取外源DNA.PEG介導法操作簡單、處理量大、融合頻率高，且不影響再生，基本上已克服了再生植株嵌合體的發(fā)生，也不需要昂貴的儀器設備.但是，這種方法需要進行長時間的原生質(zhì)體培養(yǎng)和處理，無法把握其處理效果，常常形成多元原生質(zhì)體融合體.Rasmussen等［27］通過PEG介導法將GUS基因?qū)胗筒说脑|(zhì)體，認為PEG的濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的關鍵因素.Parihar等［28］研究了熱擊和紫外線對PEG介導的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)導入甘藍型油菜的影響，認為低劑量的紫外線可以提高DNA的攝入和外源基因的表達.近年來也有運用這種方法轉(zhuǎn)化油菜原生質(zhì)體的報道.Nugent等［29］報道用 PEG介導油菜原生質(zhì)體和細胞核的轉(zhuǎn)化，并對其轉(zhuǎn)化進行了比較.

3.2.3 電激法

電激法是利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電擊穿孔”，形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的攝入.此法最早用于動物細胞的轉(zhuǎn)化，現(xiàn)在植物遺傳轉(zhuǎn)化中也廣泛使用.電激法是植物遺傳轉(zhuǎn)化的一種有效方法，已在懸浮培養(yǎng)細胞、原生質(zhì)體、組織、花粉、植物胚胎等材料中導入外源基因獲得瞬間或穩(wěn)定表達［30］.Fromm 等［31］首次報道了將電激法應用于植物的轉(zhuǎn)基因.電激法具備操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，但需依賴昂貴的儀器，較易造成原生質(zhì)體的損傷，原生質(zhì)體的分離和再生較困難，近年來對此方法的報道較少.

3.2.4 顯微注射法

顯微注射法是利用顯微注射儀將外源基因直接注入到生物的生殖細胞中，從而獲得轉(zhuǎn)基因再生植株的一種方法.顯微注射法最初主要用于動物細胞外源DNA的導入.Neuhaus等［32］首次報道了利用顯微注射法將NPTⅡ基因注入甘藍型油菜的花粉胚細胞中.但是該方法必須以精細的顯微操作技術和細胞低密度培養(yǎng)為基礎，并且必須建立固定植物細胞或原生質(zhì)體的技術，從而導致整個實驗過程非常復雜、技術難度大，因此使用率不高.

3.2.5 激光微束穿刺法

激光微束穿刺法是利用聚焦到微米級的激光微束對組織進行穿刺，引起細胞膜的可逆性穿孔，進而導入外源 DNA的方法.Weber等［33］首先用激光微束穿刺法將熒光酶素基因?qū)腚x體油菜的葉綠體中，此后又進一步證實了激光微束可定向地穿透細胞壁和質(zhì)膜，將外源基因?qū)爰毎图毎髦?王蘭嵐等［34］經(jīng)過多年的探索建立了一套用激光微束向植物細胞導入外源DNA的體系，并在世界上率先得到有分子證據(jù)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株.激光微束穿刺法操作簡單、受體材料廣泛、重復性好、靶向性極強、對細胞損傷小，但轉(zhuǎn)化效率不高、設備復雜、費用較高.

3.2.6 花粉管通道法

花粉管通道法是利用生殖細胞(花粉)作為載體，結(jié)合超聲波處理介導外源基因轉(zhuǎn)化的方法.該方法由文獻［35］建立并發(fā)展起來，成功應用在棉花、高粱、煙草等作物上.杜春芳［36］通過花粉管通道法將GUS基因?qū)胗筒嘶ǚ郏⒆C明GUS基因已整合到油菜基因組中.文獻［37］利用此方法轉(zhuǎn)化芥菜型油菜得到了抗草甘磷的植株.柴國華等［38］利用花粉管通道法將一個與含油量相關的轉(zhuǎn)錄因子WR1的反義序列導入甘藍型油菜中，經(jīng)PCR和Southern blot分析，獲得了3株轉(zhuǎn)基因植株，通過半定量PCR得出WR1的反義基因成功抑制油菜本身的BnWR1的表達.

4 遺傳轉(zhuǎn)化育種

到目前為止，用于轉(zhuǎn)化油菜的目的基因非常多，其賦予油菜的性質(zhì)各異.經(jīng)統(tǒng)計分析，油菜的轉(zhuǎn)化育種主要集中在油菜品質(zhì)改良、抗性育種和雜交體系中不育系的建立等幾個方面.

4.1 油菜品質(zhì)改良

4.1.1 脂肪酸組分的改良

油菜脂肪酸主要成分是芥酸、油酸、亞油酸和亞麻酸.近年來對油菜脂肪酸改良的報道主要有：文獻［39-40］將脂肪酸延長酶1基因(BnFAE 1)反義表達載體導入油菜，T3代轉(zhuǎn)基因油菜種子芥酸含量下降60.8% ～90.1%，油酸含量大量增加，總脂肪酸含量不變;并利用RNA干擾技術使油菜FAD2基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，從而導致轉(zhuǎn)基因油菜 T3代種子中油酸含量增加13.90%～32.20%.Taylor等［41］從小豆蒄中克隆到 3-酮類?；o酶合成酶基因(KCS)，在油菜中異源表達，使芥酸含量下降，神經(jīng)酸含量高達30%，應用于醫(yī)藥及工業(yè)生產(chǎn).Bondaruk等［42］用“貓爪”棕櫚酰?；\送蛋白基因(ACP)轉(zhuǎn)化甘藍型油菜，使油菜種子中不飽和脂肪和硬脂酸含量增加.芥酸及其衍生物是塑料膜生產(chǎn)行業(yè)中重要的可再生原料.Katavic等［43］將擬南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因?qū)敫仕{型油菜，使芥酸含量提高.

4.1.2 種子貯藏蛋白的遺傳改良

通常情況下，油菜種子中油脂和蛋白質(zhì)占有量分別為40%和20%，種子中的貯藏蛋白主要是napin和cruciferin，分別占種子總蛋白的20%和40% ～50%.文獻［44］將編碼napin蛋白的反義基因?qū)胗筒似贩NWestar中，導致其種子中napin含量下降、crucifein含量增加，但蛋白質(zhì)總量沒有變化.Poulsen等［45］將反義 cruciferin基因?qū)胗筒?，使cruciferin含量下降、napin含量增加，且賴氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸的含量也增加，從而使蛋白品質(zhì)大大提高.文獻［46］以油菜子葉柄為外植體，通過農(nóng)桿菌介導，將賴氨酸富含蛋白基因(LRP)導入甘藍型油菜，油菜種子中賴氨酸含量提高了16.7%.文獻［47］將一個裂殖子表面蛋白-1基因(MSP-1)和一個環(huán)孢子蛋白基因(CSP)拼接成一個新基因，命名為MLC，在甘藍型油菜中表達，得到一種約25 kDa的蛋白，經(jīng)驗證重組蛋白可用作醫(yī)療診斷的抗原和抗瘧疾用疫苗.

4.2 抗性育種

4.2.1 抗除草劑基因

目前用于轉(zhuǎn)化的基因主要為2種：抗草甘磷基因和抗草丁磷基因.草甘磷是目前普遍使用的非選擇性除草劑，可控制世界上大多數(shù)有害雜草，對動植物無毒性，會很快被土壤微生物分解.美國Monsanto公司將抗草甘磷的EPSP合成酶基因?qū)胗筒耍玫娇共莞柿壮輨┑挠筒?，并實現(xiàn)商業(yè)化.草丁磷是一種谷酰胺合成酶的抑制劑，抗性基因有2個：一個是克隆自土壤細菌Streptomyces hygrocopicus的BAR基因;另一個是Ghufosinate抗性基因 PAT，來自 S.viridochromogenes，2個基因表達產(chǎn)物有相似的催化能力.加拿大等國已育成了帶BAR基因的抗草丁磷油菜新品種，并已開始田間實驗［48］.Miki等［49］在擬南芥中克隆出 Ahyclroxyacid合成酶基因(AHAS)突變體，將其導入油菜，使油菜具有咪唑基除草劑的抗性.

4.2.2 抗病蟲害基因

近年來對于提高油菜抗病蟲害的研究較多.文獻［50］將孢子囊和幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗筒酥?，得到的轉(zhuǎn)基因油菜具有很強的抗小菜蛾和核盤菌能力.鄭巨云等［51］將蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白基因(Bt)和反枝覓菜凝集素基因(ARA)構(gòu)建成雙價基因表達載體，并將其轉(zhuǎn)化至油菜中，得到抗性小植株.藍海燕等［52］將 β-1，3-葡聚糖酶基因和幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗筒?，獲得轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗菌核病的能力明顯強于對照.另外，抗黑脛病基因、抗根腫病基因、抗黑腐病基因、抗黑斑病基因等都已得到轉(zhuǎn)基因植株［8］.

4.2.3 抗非生物逆境

干旱、高低溫、重金屬、高鹽堿、強紫外線等非生物逆境的存在，使植物面臨著很大的生存壓力，于是人們通過基因改造來使植物具有逆境抗性.文獻［53］將擬南芥的液泡Na+/H+反向運輸?shù)鞍谆驅(qū)胗筒酥?，獲得可以在高鹽條件下正常生長的轉(zhuǎn)基因油菜，其產(chǎn)量與質(zhì)量變化不大.文獻［54-55］分別將冷誘導基因的轉(zhuǎn)錄因子CBF1和抗旱基因COX轉(zhuǎn)入油菜，得到抗寒性和抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因材料.Gasic等［56］將擬南芥的植物絡合素基因?qū)氲浇娌诵陀筒酥?，得到穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)化株，油菜對鎘和鋅的抗性增強.文獻［57］在油菜中異源表達肌醇多磷酸化激酶基因(ThIPK2)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為具有較強的抗鹽、抗干旱、抗氧化等能力.

4.3 雜交不育系育種

通過雜種優(yōu)勢進行油菜育種一直是油菜生產(chǎn)國所重視的.傳統(tǒng)的途徑是通過細胞質(zhì)“三系”雜種、細胞核不育雜種、化學殺雄雜種和自交不親和雜種進行育種.然而，它們都存在一定的局限性.隨著分子生物學的迅速發(fā)展，通過基因工程技術培育新的雜種生產(chǎn)體系成為了可能.Mariani等［58］首先提出了創(chuàng)造不育系、恢復系及保持系的思路，將編碼核糖核酸酶基因barnase置于煙草花藥絨氈層特異表達的啟動子TA29后，并與BAR基因形成嵌合基因，然后轉(zhuǎn)化油菜，得到雄性不育系;之后又在Bacillus amyloliquefaciens細胞中發(fā)現(xiàn)一種核糖核酸酶抑制蛋白 BARSTAR，能與BARNASE蛋白高效結(jié)合形成穩(wěn)定的復合物，從而抑制BARNASE的活性，植株可以正常發(fā)育成熟的花粉粒，恢復油菜育性，保持系為原來未轉(zhuǎn)基因油菜植株.該雜交生產(chǎn)模式已在加拿大應用于生產(chǎn).Gupta等［59］將一個 α-tubulin：rolB 基因?qū)胗筒?，轉(zhuǎn)基因油菜表現(xiàn)為雄性不育.

5 轉(zhuǎn)基因油菜存在的問題及展望

至今，油菜轉(zhuǎn)基因及其應用已取得了長足的進展，油菜轉(zhuǎn)基因體系日臻成熟，但仍存在較多的缺陷和有待解決的問題：

1)提高油菜轉(zhuǎn)化體系的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)化率

近年來伴隨著轉(zhuǎn)基因技術的快速發(fā)展，作為經(jīng)濟作物的油菜，其研究受到關注.研究表明，油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立主要受以下因素的影響：基因型、受體材料、苗齡、濕度、光照等環(huán)境因子及植物激素、抗生素和Ag+離子等.隨著對油菜基因轉(zhuǎn)化研究的不斷深入，已有越來越多的油菜栽培品種應用于基因的改良，特別是對于油菜轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化，使油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系趨向于穩(wěn)定，特別是農(nóng)桿菌介導的花絮浸泡方法，不受品種的限制，前景更開闊.

2)提高轉(zhuǎn)基因油菜外源基因的表達調(diào)控及其遺傳穩(wěn)定性

目前導入的外源基因整合到油菜基因組中是隨機的，其表達水平、表達部位、表達時間等都存在不確定性.另外，由于外源基因是隨機插入的，其在油菜基因組中的拷貝數(shù)是不確定的，并且常常會出現(xiàn)外源基因的沉默，或轉(zhuǎn)基因植株為嵌合體(chimera).因此，轉(zhuǎn)基因植株應盡量避免外源基因的沉默和嵌合體的形成.

為了更好地優(yōu)化油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，我們?nèi)孕鑼τ筒说纳L發(fā)育分子機理進行深入的研究，使用其本身特定的啟動子、優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法等策略來避免這些問題，并提高其遺傳穩(wěn)定性.

3)轉(zhuǎn)基因油菜的安全性問題

隨著基因工程改良作物的增加及其國際性產(chǎn)業(yè)化趨勢的擴大，轉(zhuǎn)基因作物的安全性已成為全球性的熱門話題.首先，轉(zhuǎn)基因油菜環(huán)境釋放后是否會對其他生物造成危害或影響，如：抗病蟲害基因是否也會毒殺一些有益的昆蟲和動物?抗除草劑基因是否會使得一些雜草經(jīng)過環(huán)境選擇后變成超級雜草或它自身也可能雜草化?其次，轉(zhuǎn)基因油菜環(huán)境釋放后，由于遺傳物質(zhì)的橫向傳遞，對一些野生物種可能會造成污染，特別是親源關系很近的植物.浦惠明等［60］研究了轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜對近緣作物的基因漂流，發(fā)現(xiàn)對蕓苔屬黑芥、埃芥、芥菜型油菜、白菜型油菜、甘藍型油菜的漂移率為0.02% ～3.00%.李鍵等［61］研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜的外源Barstar基因向周圍非轉(zhuǎn)基因油菜和新疆野生油菜進行轉(zhuǎn)移.宋小玲等［62］研究發(fā)現(xiàn)抗草丁磷油菜和抗草甘磷油菜與野芥菜田間隔行種植分別產(chǎn)生0.020%和0.014%的攜帶抗性基因的F1雜種.Gressel［63］就轉(zhuǎn)基因油菜種子特性表達基因的漂流問題進行了報道.最后，轉(zhuǎn)基因油菜在食用方面是否是安全的?這一系列的問題都需要去解答.

總之，自人類獲得第一株轉(zhuǎn)基因植物至今20余年時間里，植物基因工程的研究與應用已取得了重大的進展.轉(zhuǎn)基因油菜的研究與生產(chǎn)備受矚目，特別是隨著世界能源和糧食危機愈演愈烈，科學家在努力尋找石油的替代品，生物柴油成為解決這些問題的關鍵途徑之一，而油菜作為最重要的油料作物之一成為制造生物柴油的最佳選擇.另外，據(jù)中國油糧信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，2009年我國油菜籽的播種面積預計為3 070萬hm2，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的22.5%，提供的菜籽油占全國食用油的40%～45%，油菜在我國國民經(jīng)濟中的地位舉足輕重.因此，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的油菜新品種勢在必行.特別是近年分子生物技術應用于油菜育種，大大加速了油菜育種的進程，在我國已有很多實驗室成功建立了油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系.我們在正確認識和解決油菜轉(zhuǎn)基因問題的同時，要很好地利用轉(zhuǎn)基因油菜的發(fā)展?jié)摿?

［1］Horsch R，F(xiàn)ry J，Hoffmann N，et al.A simple and general method for transferring genes into plants［J］.Science，1985，227(4691)：1229-1231.

［2］Moloney M M，Walker J M，Sharma K K.High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors［J］.Plant Cell Reports，1989，8(4)：238-242.

［3］Maheshwari P，Selvaraj G，Kovalchuk I.Optimization of Brassica napus(canola)explant regeneration for genetic transformation［J］.New Biotechnology，2011，29(1)：144-155.

［4］Tang G X，Knecht K，Yang X F，et al.A two-step protocol for shoot regeneration from hypocotyl explants of oilseed rape and its application for Agrobacterium-mediated transformation［J］.Biologia Plantarum，2011，55(1)：21-26.

［5］Fry J，Barnason A，Horsch R B.Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors［J］.Plant Cell Reports，1987，6(5)：321-325.

［6］Burbulis N，Blinstrubiene A，Kuprieneet R，et al.In vitro regeneration of Brassica napus L.shoots from hypocotyls and stem segments［J］.Zemdirbyste-Agriculture，2009，96(3)：176-184.

［7］Dutta I，Saha P，Das S.Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation of oilseed mustard(Brassica juncea(L.)Czern.)using leaf piece explants［J］.In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology-Plant，2008，44(5)：401-411.

［8］段英姿，牛應澤，郭世星.油菜基因工程研究進展［J］.中國農(nóng)學通報，2003，19(5)：92-98.

［9］Lichter R.Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus［J］.Zeitschrift für Pflanzenphysiologie，1982，105(5)：427-434.

［10］Abdollahi M R，Moieni A，Mousavi A，et al.High frequency production of rapeseed transgenic plants via combination of microprojectile bombardment and secondary embryogenesis of microspore-derived embryos［J］.Molecular Biology Reports，2011，38(2)：711-719.

［11］Schr?der M，Dixelius C，R?hlén L，et al.Transformation of Brassica napus by using the aadA gene as selectable marker and inheritance studiesof the marker genes［J］.Physiologia Plantarum，1994，92(1)：37-46.

［12］Wang J X，Zhao F Y，Xu P.Use of aroA-M1 as a selectable marker for Brassica napus transformation［J］.Crop Science，2006，46(2)：706-711.

［13］Wallbraun M，Sonntag K，Eisenhauer C，et al.Phosphomannose-isomerase(pmi)gene as a selectable marker for Agrobacterium-mediated transformation of rapeseed［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2009，99(3)：345-351.

［14］Santarem E，Trick H，Essig J，et al.Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons：optimization of transient expression［J］.Plant Cell Reports，1998，17(10)：752-759.

［15］Metz T D，Dixit R，Earle E D.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of broccoli(Brassica oleracea var.italica)and cabbage(B.oleracea var.capitata)［J］.Plant Cell Reports，1995，15(3/4)：287-292.

［16］Henzi M X，Christey M C，McNeil D L.Factors that influence Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of broccoli(Brassica oleracea L.var.italica)［J］.Plant Cell Reports，2000，19(10)：994-999.

［17］Higgins J D，Newbury H J，Barbara D J，et al.The production of marker-free genetically engineered broccoli with sense and antisense ACC synthase 1 and ACC oxidases 1 and 2 to extend shelf-life［J］.Molecular Breeding，2006，17(1)：7-20.

［18］付紹紅，牛應澤，楊洪全，等.表面活性劑silwet-77對floral-dip轉(zhuǎn)化甘藍型油菜效果的影響［J］.分子植物育種，2004，2(5)：661-666.

［19］Li Juan，Tan Xiaoli，Zhu Fuge，et al.A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets［J］.International Journal of Biology，2010，2(1)：127-131.

［20］Zhou Bo，Lin Jianzhong，Peng Wusheng，et al.Dwarfism in Brassica napus L.induced by the over-expression of a gibberellin 2-oxidase gene from Arabidopsis thaliana［J］.Molecular Breeding，2012，29(1)：115-127.

［21］楊柳，劉忠松.油菜農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進展［J］.作物研究，2007，21(5)：650-653.

［22］Song Li，Zhao Degang，Wu Yongjun，et al.A simplified seed transformation method for obtaining transgenic Brassica napus plants［J］.Agricultural Sciences in China，2009，8(6)：658-663.

［23］Sanford J C，Klein T M，Wolf E D，et al.Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process［J］.Particulate Science and Technology，1987，5(1)：27-37.

［24］侯丙凱，陳正華.蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因克隆及油菜葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化研究［J］.遺傳，2001，23(1)：39-40.

［25］Cheng Lin，Li Heping，Qu Bo，et al.Chloroplast transformation of rapeseed(Brassica napus)by particle bombardment of cotyledons［J］.Plant Cell Reports，2010，29(4)：371-381.

［26］Krens F A，Molendijk L，Wullems G J，et al.In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA［J］.Nature，1982，296(5852)：72-74.

［27］Rasmussen J O，Rasmussen O S.PEG mediated DNA uptake and transient GUS expression in carrot，rapeseed and soybean protoplasts［J］.Plant Science，1993，89(2)：199-207.

［28］Parihar D S，Maheshwari S C，Khurana P.Influence of heat shock and UV irradiation on PEG-mediated DNA uptake and transient expression of nptII gene in protoplasts of Brassica napus［J］.Indian Journal of Experimental Biology，1998，36(10)：1002-1006.

［29］Nugent G D，Coyne S，Nguyen T T，et al.Nuclear and plastid transformation of Brassica oleracea var.botrytis(cauliflower)using PEG-mediated uptake of DNA into protoplasts［J］.Plant Science，2006，170(1)：135-142.

［30］黃洪云，那日.電激法介導作物種子基因轉(zhuǎn)移的研究與進展［J］.種子，2007，26(2)：52-55.

［31］Fromm M，Taylor L P，Walbot V.Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation［J］.Proc Nati Acad Sci USA，1985，82(17)：5824-5828.

［32］Neuhaus G，Spangenberg G，Mittelsten S O，et al.Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived embryoids［J］.Theor Appl Genet，1987，75(1)：30-36.

［33］Weber G，Monajembashi S，Greulich K，et al.Genetic manipulation of plant cells and organelles with a laser microbeam［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1998，12：219-222.

［34］王蘭嵐，宋桂英，張健，等.利用微束激光將外源基因?qū)胄←溣着卟@得轉(zhuǎn)基因植株的研究［J］.激光生物學，1993，2(2)：277-278.

［35］Zhou Guangyu，Weng Jian，Zeng Yishen，et al.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos［J］.Methods Enzymol，1983，101：433-481.

［36］杜春芳.花粉介導法在油菜轉(zhuǎn)基因育種中的應用研究［D］.太谷：山西農(nóng)業(yè)大學，2004.

［37］Wang Jingxue，Li Yonghu，Liang Chao.Recovery of transgenic plants by pollen-mediated transformation in Brassica juncea［J］.Transgenic Research，2008，17(3)：417-424.

［38］柴國華，白澤濤，蔡麗，等.油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi對種子含油量的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2009，42(5)：1512-1518.

［39］Tian Baoming，Wei Fang，Shu Haiyang，et al.Decreasing erucic acid level by RNAi-mediated silencing of fatty acid elongase 1(BnFAE1.1)in rapeseeds(Brassica napus L.)［J］.African Journal of Biotechnology，2011，10(61)：13194-13201.

［40］Tian Baoming，Sun Dandan，Lian Yuli，et al.Analysis of the RNAi targeting FAD2 gene on oleic acid composition in transgenic plants of Bras-sica napus［J］.African Journal of Microbiology Research，2011，5(7)：817-822.

［41］Taylor D C，F(xiàn)rancis T，Guo Yiming，et al.Molecular cloning and characterization of a KCS gene from Cardamine graeca and its heterologous expression in Brassica oilseeds to engineer high nervonic acid oils for potential medical and industrial use［J］.Plant Biotechnology Journal，2009，7(9)：925-938.

［42］Bondaruk M，Johnson S，Degafu A，et al.Expression of a cDNA encoding palmitoyl-acyl carrier protein desaturase from cat's claw(Doxantha unguis-cati L.)in Arabidopsis thaliana and Brassiea napus leads to accumulation of unusual unsaturated fatty acids and increased stearic acid content in the seed oil［J］.Plant Breeding，2007，126(2)：186-194.

［43］Katavic V，F(xiàn)riesen W，Barton D L，et al.Improving erucic acid content in rapeseed through biotechnology what can the arabidopsis FAE1 and the yeast SLC1-1 genes contribute? ［J］.Crop Science，2001，41(3)：739-747.

［44］Kohno-Murase J，Murase M，Ichikawa H，et al.Effects of an antisense napin gene on seed storage compounds in transgenic Brassica napus seeds［J］.Plant Molecular Biology，1994，26(4)：1115-1124.

［45］Poulsen G.Genetic transformation of Brassica［J］.Plant Breeding，1996，115(4)：209-225.

［46］Wang J，Chen L，Liu Q Q，et al.Transformation of LRP gene into Brassica napus mediated by Agrobacterium tumefaciens to enhance lysine content in seeds［J］.Genetika，2011，47(12)：1616-1621.

［47］Lee C，Kim H H，Choi K M，et al.Murine immune responses to a Plasmodium vivax-derived chimeric recombinant protein expressed in Brassica napus［J］.Malaria Journal，2011，10(1)：106.

［48］孫萬倉.轉(zhuǎn)基因油菜研究進展［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2000，9(3)：117-121.

［49］Miki B，McHugh S.Selectable marker genes in transgenic plants：applications，alternatives and biosafety［J］.Journal of Biotechnology，2004，107(3)：193-232.

［50］Liu Hongbo，Guo Xiang，Naeem M S，et al.Transgenic Brassica napus L.lines carrying a two gene construct demonstrate enhanced resistance against Plutella xylostella and Sclerotinia sclerotiorum［J］.Plant Cell Tissue and Organ Culture，2011，106(1)：143-151.

［51］鄭巨云，陳正華，劉桂珍，等.抗蟲雙價基因表達載體的構(gòu)建及微束激光轉(zhuǎn)化植物研究［J］.激光生物學報，2008，17(4)：446-454.

［52］藍海燕，王長海，張麗華，等.導入β-1，3-葡聚糖酶及幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因可育油菜及其抗菌核病的研究［J］.生物工程學報，2000，16(2)：142-146.

［53］Zhang Hongxia，Hodson J N，Williams J P，et al.Engineering salt-tolerant Brassica plants：characterization of yield and seed oil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation［J］.Proc Nati Acad Sci，2001，98(22)：12832-12836.

［54］甄偉，陳溪，孫思洋，等.冷誘導基因的轉(zhuǎn)錄因子CBFl轉(zhuǎn)化油菜和煙草及抗寒性鑒定［J］.自然科學進展，2000，10(12)：1104-1108.

［55］Huang Jun，Hirji R，Adam L，et al.Genetic engineering of glycinebetaine production toward enhancing stress tolerance in plants：metabolic limitations［J］.Plant Physiology，2000，122(3)：747-756.

［56］Gasic K，Korban S S.Expression of Arabidopsis phytochelatin synthase in Indian mustard(Brassica juncea)plants enhances tolerance for Cd and Zn［J］.Planta，2007，225(5)：1277-1285.

［57］Zhu Jinqi，Zhang Jiantao，Tang Renjie，et al.Molecular characterization of ThIPK2，an inositol polyphosphate kinase gene homolog from Thellungiella halophila，and its heterologous expression to improve abiotic stress tolerance in Brassica napus［J］.Physiologia Plantarum，2009，136(4)：407-425.

［58］Mariani C，Gossele V，De Beuckeleer M，et al.A chimaeric ribonuclease-inhibitor gene restores fertility to male sterile plants［J］.Nature，1992，357：384-387.

［59］Gupta R，Gahalain S S.Agrobacterium tumefaciens-mediated transfer of a-tubulin：rolB gene for inducing male-sterility in oilseed rape(Brassica napus L.)［J］.Vegetos，2007，20(2)：1-5.

［60］浦惠明，戚存扣，張潔夫，等.轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜對近緣作物的基因漂移［J］.生態(tài)學報，2005，25(3)：581-588.

［61］李健，官春云，李栒，等.轉(zhuǎn)基因油菜的外源Barstar基因向近緣種的轉(zhuǎn)移研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2006，32(6)：591-595.

［62］宋小玲，皇甫超河，強勝.抗草丁膦和抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因向野芥菜的流動［J］.植物生態(tài)學報，2007，31(4)：729-737.

［63］Gressel J.Gene flow of transgenic seed-expressed traits：biosafety considerations［J］.Plant Science，2010，179(6)：630-634.

Progress of gene transformation methods in rapeseed

TU Shiwei1， GUO Wanli2， JIANG Lixi2， PAN Jianwei1

(1.College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China;2.Department of Crop Science，College of Agricuture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou Zhejiang 310012，China)

It was reviewed the rapeseed explant types，selection markers，transformation methods，the influence factors of regeneration systems and its applications in rapeseed breeding were discussed.It was also mentioned the problems and development in the future of rapeseed transformation.It was found that there were still limitations in the transformation of rapeseeds through the published papers and establishment of transformation system of rapeseeds.Firstly，the process of receptor regeneration was a long period and the frequency of gene transformation was low.Secondly，the introduced gene might be silent and the expression of transferred gene would unstable in the progeny.Thirdly，the scientific evaluation should be made about the bad influence of transgenic rapeseed to human heath and the natural environment.Moreover，more complete law and rule should be made to supervise the environment release of transgenic plants.At the same time，it should meet the needs of people by modifying the trait of rapeseeds.Furthermore，there would be a wide foreground to produce the substitute of energy source by introducing special gene into rapeseed plants.

rapeseed;transformation;explants;selection markers;transgenic methods

Q78;S565.4

A

2012-03-02

涂世偉(1985-)，男，江西南昌人，碩士研究生.研究方向：植物分子遺傳.

1001-5051(2012)03-0338-08

(責任編輯 薛 榮)

油菜屬于十字花科(Cruciferae)蕓苔屬(Brassicae)，主要包括甘藍型油菜(Brassica napus)、芥菜型油菜(Brassica Juncea)和白菜型油菜(Brassica rapa).油菜是四大油料作物之一，位居全球五大經(jīng)濟作物之列，是食用植物油和蛋白的重要來源.自1985年［1］首次利用根癌農(nóng)桿菌介導法獲得轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜以來，科研人員越來越青睞應用基因工程改良油菜品種.本文重點對外植體類型、篩選標記、轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)基因技術在油菜遺傳轉(zhuǎn)化方面的應用及成果進行了綜述，同時也對轉(zhuǎn)基因油菜所存在的問題和前景進行了探討.