蛇毒的研究進展及其在醫(yī)藥領域的應用*

王艷妮， 鮑毅新

(浙江師范大學生態(tài)研究所，浙江金華 321004)

蛇毒是從毒蛇的毒腺中分泌出來的一種毒液，屬于生物毒素．毒蛇咬傷人或其他動物時，位于其頭部兩側(cè)眼后下方的毒腺分泌蛇毒，蛇毒經(jīng)排毒導管進入其毒牙鞘內(nèi)，經(jīng)插入被咬者傷口的毒牙擠壓入傷者體內(nèi)，毒液隨被咬者血液和淋巴擴散而引起傷者出現(xiàn)中毒癥狀［1］．蛇毒的成分十分復雜，主要有蛋白質(zhì)、活性肽和一些酶類［2］．隨著毒理學、藥理學、生物化學和分子生物學的發(fā)展，蛇毒的許多組分已經(jīng)得到分離純化，并進行了較為深入的研究．

據(jù)統(tǒng)計，全世界蛇類有2 700多種，其中毒蛇有600多種．我國的蛇類資源豐富，約有200多種，其中毒蛇約為48種，但具有劇毒的蛇大約僅有10多種［3］．本文就國內(nèi)外主要毒蛇的蛇毒組分、對凝血系統(tǒng)的影響及蛇毒在醫(yī)藥領域的應用等方面的研究進展進行了綜述，以期為開展有關蛇毒的研究提供一些基礎資料．

1 蛇毒組分

蛇毒的主要成分為蛋白質(zhì)和多肽，故具有蛋白質(zhì)的通性．如:加熱和受紫外線照射會產(chǎn)生絮狀沉淀，導致毒性部分或全部喪失;遇強酸、強堿、氧化劑、還原劑、消化酶、重金屬鹽等能被破壞;能被蛋白酶水解;經(jīng)甲醛處理會喪失毒性，但抗原性仍能保留等［4］．多數(shù)學者認為，人和動物的消化道腺體分泌的消化液能破壞蛇毒．另外，肝臟對蛇毒有解毒作用，而且70%的蛇毒可隨尿液排出［5］．

蛇毒的化學成分十分復雜，主要可分為以下5類:1)酶．蛇毒中的酶約占蛇毒蛋白組分的50%，這些酶與蛇咬傷造成的出血、水腫及血凝失調(diào)有密切的關系．目前已分離純化的蛇毒蛋白酶約150種［6］，大多數(shù)屬于水解酶．按其主要毒理作用，可分4類:引起局部毛細血管和組織損傷與壞死作用的酶類;引起降壓、水腫和疼痛等作用的激肽釋放酶;引起血凝障礙的酶;以及引起纖溶作用的酶類．一些蛇毒的突觸前神經(jīng)毒素具有蛇毒磷脂酶A2(PLA2)活性，如β-銀環(huán)蛇毒素、泰攀蛇毒素、虎蛇毒素、響尾蛇毒素和蝮蛇毒素．PLA2能水解各種磷脂類，增加紅細胞膜的通透性［7-8］．而且，PLA2非常穩(wěn)定，經(jīng)高溫、低pH條件處理仍能保留酶的活性．2)神經(jīng)毒性多肽．它們是分子量較小的蛋白質(zhì)或多肽．一種蛇毒中可以有多種神經(jīng)毒素．大多數(shù)為堿性，對熱穩(wěn)定，可通過透析袋．按藥理學作用可分為作用于神經(jīng)突觸前膜、后膜2類，前者包括β-銀環(huán)蛇毒素、虎蛇毒素及蝮蛇突觸前神經(jīng)毒素，其余的神經(jīng)毒素均屬后者［9］．3)神經(jīng)生長因子(NGF)．它是神經(jīng)系統(tǒng)最為重要的生長活性分子之一，對損傷神經(jīng)有調(diào)節(jié)修復作用，而且對傷口愈合、生殖、早期造血等都有一定的作用．所有蛇毒中均含有一定量的神經(jīng)生長因子．由于其獨特的生物學活性，Lipps［10］采用高效液相色譜(HPLC)技術對響尾蛇科、蝰科及眼鏡蛇科3類蛇毒中的神經(jīng)生長因子進行了分離和純化，并對其生物學和免疫學特性進行了分析．Eugenia等［11］也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子能顯著抑制糖尿病患者背根神經(jīng)節(jié)細胞的減少，并能增強神經(jīng)纖維的再生．4)膜活性多肽．多為堿性多肽，能直接溶解紅細胞，可改變細胞膜通透性而形成細胞的滲漏，并使膜上的酶易于溶出，對心臟、骨骼肌、周圍神經(jīng)等均可產(chǎn)生有害作用［12］．5)其他生物活性肽．如蛇毒C型凝集素，是一類依賴Ca2+的可以和糖類結(jié)合的蛋白質(zhì)．例如非洲鼓蝮蝰蛇(Bitis ariatans)中的半乳糖結(jié)合蛋白(PAL)［13］、西部菱斑響尾蛇(Crotalus atrox)凝集素(RSL)［14］、竹葉青半乳糖結(jié)合蛋白(TSL)［15］等．涂碩等［16］運用 DNAstar和 Antheprot軟件對蛇毒 C型凝集素蛋白(CLP)家族的二級結(jié)構和表面特性進行了分析．

總之，不同的毒蛇分泌不同性質(zhì)的蛇毒，即使是同種毒蛇，如果在不同的產(chǎn)地，也可能在蛇毒成分上存在一些差異［17］．

2 蛇毒組分對凝血系統(tǒng)的影響

人體凝血系統(tǒng)是由多種成分參與調(diào)節(jié)的復雜生理反應系統(tǒng)．蛇毒中的許多成分，包括蛋白質(zhì)、多肽等，可通過作用于此系統(tǒng)的不同環(huán)節(jié)而引起抑制或激活作用［18］．

2．1 促凝血作用

蛇毒，尤其是蝮蛇科蛇毒中含有許多可影響凝血和纖溶系統(tǒng)的組分．每種毒蛇的毒液中并不一定含有下述所有活性成分，但下述的每種活性成分至少已從1種以上的蛇毒中分離純化出來．

2．1．1 激活凝血因子Ⅴ(FⅤ)

許多種蛇毒的活性組分都能激活FⅤ．早在20世紀70年代就從圓斑蝰蛇蛇毒中分離出一種可激活FⅤ的絲氨酸蛋白酶，其分子量為26 ku．它通過裂解FⅤ上的單一肽鍵，使 FⅤ轉(zhuǎn)化為FⅤa［18］而發(fā)揮作用．Gerads 等［19］報告了幾種眼鏡蛇的毒液中含有FⅤ激活物．

2．1．2 激活凝血因子Ⅹ(FⅩ)

蝰科、響尾蛇科和眼鏡蛇科的蛇毒素中含有多種激活FⅩ的組分．Tans等［20］專門對蛇毒中已經(jīng)純化的FⅩ激活組分的結(jié)構和功能特征進行了總結(jié)．目前已有10多種蛇毒的FⅩ激活組分被分離純化及定性．了解最多且激活FⅩ作用最強的是從圓斑蝰蛇蛇毒中分離出來一種組分，被稱為RVV-Ⅹ．從其他幾種毒蛇，如巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)的毒液中也分離出FⅩ的激活成分．RVV-Ⅹ屬于金屬蛋白酶．其活性是Ca2+依賴性的，在Ca2+、磷脂及FⅤa存在下激活凝血酶原，同時也可激活FⅨ和蛋白C［17］．激活 FⅩ的絲氨酸蛋白酶分子量較小，約20～30 ku，其活性為非Ca2+依賴性，目前僅從角蝰(Cerastes cerastes)和紅口蝮(Calloselasma rhodostoma)的蛇毒中分離純化出來，盡管在Ca2+存在下其激活FⅩ的活性明顯增高，但在無Ca2+存在下也能激活FⅩ［21］．

2．1．3 激活凝血因子Ⅸ(FⅨ)

通過裂解單一肽鍵激活FⅨ，但產(chǎn)生的FⅨ的分子量并不改變，這與正常生理情況下凝血因子Ⅺa(FⅪa)活化FⅨ的方式不同，后者產(chǎn)生的FⅪa分子量下降．

2．1．4 激活凝血酶原

凝血酶原是一個維生素K依賴的單鏈糖蛋白，分子量為72 ku，在凝血瀑布中起十分重要的作用．許多蛇毒中存在凝血酶原的激活成分，按其結(jié)構特性及所需輔助因子的不同可分為以下幾類:1)金屬蛋白酶類，分子量為50～70 ku，作用于肽鍵Arg320—Arg521，將凝血酶原直接裂解為一中間產(chǎn)物，后者自動轉(zhuǎn)化為凝血酶．這類蛋白酶的活性不受凝血酶原酶復合物(Ca2+、磷脂及FⅤa)的影響［22］．從鋸鱗蝰(Echis carinatus)蛇毒中分離純化的Ecarin是此類酶的代表．2)與FⅨa類似，裂解凝血酶原中的2個肽鍵，形成具有凝血活性的雙鏈凝血酶．該類蛇毒成分對凝血酶原的裂解需Ca2+、磷脂及FⅤa的存在．此類成分僅在澳大利亞眼鏡蛇科的蛇毒中分離純化得到，其中以從虎蛇(Notechis scutatus)蛇毒中提取的Notecarin研究得最清楚［23］．3)這類成分也僅在澳大利亞眼鏡蛇科的蛇毒中分離得到，其代表是從泰攀蛇(Oryuranus scutellatus)蛇毒中分離純化出的Oscutarin．此類成分的特點是分子量較大，約為300～380 ku，由大小2個亞單位組成:小亞單位為絲氨酸蛋白酶，具有與FⅩa相似的活性;大亞單位的功能與FⅤa在生理凝血過程中所起的作用相似．Oscutarin對凝血酶原的激活不需要FⅤa的參與，僅需要Ca2+和磷脂［18］．4)這類成分催化裂解凝血酶原中的肽鍵，不直接產(chǎn)生具有酶活性的產(chǎn)物，僅產(chǎn)生無凝血酶活性的凝血酶原1和凝血酶原2［24］．這類成分已從多種蛇毒中分離純化，有些基因已克隆并在原核、真核細胞中成功表達．近來，Yamada等［25］從2種蝰蛇蛇毒中分離純化出一類新的凝血酶原激活劑，不屬于上述任何類別，這2種蛋白(CA-1和 Multactivase)具有與RVV-Ⅹ相同的結(jié)構特點，即分子由催化和調(diào)節(jié)2個亞單位通過非共價鍵的緊密結(jié)合而成．

2．1．5 激活凝血因子Ⅻ(FⅫ)

Marrukchi等［26］從角蝰蛇毒中分離純化出一種絲氨酸蛋白酶Cerastocytin，分子量為62 ku，將此種蛋白酶和纖維蛋白原(含微量FⅫ)于37℃孵育1 h后，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示有γ-γ二聚體和α-聚集體的形成，證實Cerastocytin確實具有激活FⅫ的作用．

2．1．6 直接促纖維蛋白原聚集

這類成分稱為類凝血酶(TLE)，主要存在于蝰科的蝰亞科和蝮亞科蛇毒中．所有的TLE都存在Asp189，可以裂解纖維蛋白原的精氨酸鍵，直接促進纖維蛋白原聚集［22］．此類酶中已有多種進行了cDNA克隆，有些已成功地在原核或真核細胞中進行了表達［18，21］．

2．2 抗凝作用

蛇毒中含有許多具有直接抗凝活性的成分，主要包括以下5種:1)激活蛋白C．它是維生素K依賴性的雙鏈絲氨酸蛋白酶，凝血酶在內(nèi)皮細胞表面通過凝血調(diào)節(jié)蛋白的介導激活蛋白C．活化蛋白C通過降解FⅤa和FⅧ產(chǎn)生抗凝作用．許多毒蛇包括圓斑蝰蛇的蛇毒都具有弱的活化蛋白C的活性［23］．Klein 等［27］從銅頭蝮(Agkistrodom contotrix)蛇毒中分離純化出一種分子量約為40 ku的蛋白C激活劑，此組分對蛋白C具有高度特異性，蛋白的氨基酸序列分析顯示為一種絲氨酸蛋白酶．此外，從湖南產(chǎn)原矛頭蝮蛇毒中也分離出一個新穎的雙鏈絲氨酸蛋白酶PMSP-A，能夠依次降解纖維蛋白原的Bβ和Aα鏈，從而產(chǎn)生纖溶作用［28］．2)抑制凝血酶．Zingali等［29］從蛇毒中分離出一種分子量為27 ku的蛋白成分Bothrojaracin，2條鏈經(jīng)二硫鍵橋連接而成，與凝血酶分子上的外接點(exosite)經(jīng)非共價鍵結(jié)合，產(chǎn)生強烈的抗凝血酶活性．3)同凝血因子Ⅹ/Ⅸ結(jié)合，抑制2種因子的活化．Atodo研究小組［30］從黃綠烙鐵頭(Trimeresurus flavoviridis)蛇毒中分離純化了2種蛋白質(zhì)，抑制2種凝血因子的活化，產(chǎn)生抗凝作用．這2種蛋白cDNA的開放閱讀框架的同源性達91%．具有類似分子結(jié)構和活性的蛇毒成分也已從其他蛇毒如美洲矛頭蝮(Bothrops jararaca)蛇毒中分離得到．4)磷脂酶的抗凝活性．磷脂酶在蛇毒中的分布極其廣泛，且功能多樣．一些磷脂酶可直接誘導/抑制血小板聚集，而另外一些磷脂酶具有水解或單純同血漿或血小板膜磷脂結(jié)合的活性，從而產(chǎn)生抗凝作用［12］．5)C-型凝集素．代表一個識別碳水化合物配體、依賴于Ca2+參與的糖原結(jié)合蛋白家族．C-型真凝集素能以Ca2+依賴的方式，通過特異性的糖基結(jié)合作用而凝集紅血球;C-型凝集素樣蛋白分子能通過非共價的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，作用于血液凝固因子及血小板，從而發(fā)揮抗凝或促凝作用［31］．從尖吻蝮蛇蛇毒中分離的Agkisacutacin就是一種C-型凝集素樣蛋白分子，能顯著降低全血粘度，延長凝血時間，抑制血小板聚集形成血栓［32］．還有具有其他抗凝機制的組分．如竹葉青蛇毒具有很強的抗凝活性，這種抗凝作用的機制可能是蛇毒中含有抑制凝血酶原酶復合物形成的成分，即抑制FⅩa，F(xiàn)Ⅴ，Ca2+和凝血酶原及血小板磷脂基質(zhì)的相互作用．

3 蛇毒在醫(yī)學領域中的應用

近40多年來，國際上對蛇毒的研究進展十分迅速．在印度、巴西、俄羅斯和中國都有許多專門的蛇毒研究機構．迄今為止，關于蛇毒在醫(yī)藥領域的應用主要集中在以下5個方面．

3．1 促凝作用

1936年Klobusitzky首次成功地從巴西矛頭蝮蛇的毒液中分離提純得到了一種蛇酶制劑［18］，為現(xiàn)在國內(nèi)外醫(yī)院使用最多的止血藥——立止血，又稱蛇毒凝血酶，能縮短出血和凝血時間．該藥注射1單位后10 min即產(chǎn)生止血作用，經(jīng)20 min即可使健康人正常凝血時間縮短1/2～1/3，24 h后作用消失．這種蛇毒凝血酶在沒有Ca2+存在時也能使血液凝固，不會誘發(fā)任何血管內(nèi)凝血現(xiàn)象，故不會引起血栓，已廣泛運用于臨床上預防和治療各種出血．許偉國等［33］報道從白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒中提純了一種促凝成分，通過實驗發(fā)現(xiàn)該促凝成分在家兔體內(nèi)外均有明顯促進凝血的作用，且效應強度與濃度呈正相關關系．體外實驗表明，促凝組分具有凝血酶樣作用，能縮短凝血酶時間(TT)、白陶土部分凝血活性時間(KPTT)、凝血酶原時間(PT)和復鈣時間(RT);體內(nèi)實驗結(jié)果與體外實驗結(jié)果基本相符．從白眉蝮蛇蛇毒中分離出的血凝酶已成功地應用于臨床，在外科手術中能顯著減少出血量和縮短手術時間，且對正常凝血功能無影響［34］．

3．2 溶栓作用

心肌梗塞、動/靜脈血栓和腦梗死等血栓類疾病嚴重危害著人類的健康．抗栓類藥物的研究已經(jīng)成為當今新藥研究領域的熱點之一．目前，國內(nèi)外已有不少蛇毒抗栓劑應用于臨床．如:從馬來西亞紅口蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒中分離得到的 Ancrod［35］．齊魯制藥廠研究所［36］應用親和色譜和分子篩柱分離，從東北白眉蝮蛇毒中分離純化的單一成分——降纖酶．1984年沈陽藥學院和解放軍238醫(yī)院發(fā)掘了長白山地區(qū)的蝮蛇資源，從白眉蝮蛇蛇毒中分離提取到一種抗栓酶，取名為“清栓酶”，是動物毒素在臨床應用中研究得最深入、推廣得最普及的成功范例［37］．另外，據(jù)報道，在棕點竹葉青［38］、黃綠烙鐵頭、毒蝰及尖吻蝮蛇［39］中均分離出對血小板聚集有抑制作用的成分，這些成分是5'-核苷酸酶、腺二磷酸酶、酸性或堿性磷酸酶A．然而，黎肇炎［40］從短尾蝮蛇毒中純化的抗血小板聚集蛋白，雖然具有磷脂酶A的活性，但經(jīng)過試驗，表明該蛋白是一種不依賴于磷脂酶A的特異蛋白或多肽，其作用和性質(zhì)類似于文獻［41］從蝮蛇毒中純化得到的Halysin，但它們的分子量不同．

3．3 鎮(zhèn)痛作用

文獻［42］記載，用眼鏡蛇整體泡酒飲服可治療腰腿痛．20世紀60年代初，江蘇新醫(yī)學院開始對眼鏡蛇毒進行系統(tǒng)研究，如原料標準、注射劑質(zhì)量控制標準、安全試驗、半數(shù)致死量(LD50)試驗、藥理學、藥效學等，結(jié)果表明該蛇毒及其制劑治療風濕痛、神經(jīng)痛等療效高于毒副反應［43］．1976年，昆明動物研究所等將眼鏡蛇毒進行分離，在羧甲基纖維素色譜的第5峰提純其神經(jīng)毒素，其制劑定名為“克痛靈”［44］，臨床上用于治療各種慢性神經(jīng)痛效果較佳．多數(shù)觀點認為蛇毒的毒性機制與鎮(zhèn)痛機制相同或相關，歸因于蛇毒與煙堿型膽堿受體結(jié)合，拮抗乙酰膽堿與受體的作用，阻斷神經(jīng)沖動的傳遞．為了尋找鎮(zhèn)痛效果好的新型鎮(zhèn)痛藥，王春曉等［45］對浙江眼鏡蛇蛇毒的鎮(zhèn)痛活性組分進行了分離純化，并獲得了具有鎮(zhèn)痛活性的單一組分．此外，尖吻蝮蛇毒［46］、江浙蝮蛇毒［47］、舟山眼鏡蛇毒［48］中的鎮(zhèn)痛組分也被分離得到，鎮(zhèn)痛機制也得到了進一步研究．用蛇毒作為鎮(zhèn)痛劑，具有作用顯著而且持久、安全范圍寬、連續(xù)用藥無耐藥性等優(yōu)點．

3．4 降壓作用

研究發(fā)現(xiàn)，蛇毒中存在著能降低血壓的酶類．這種酶能阻斷血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化，從而降低了人體血管緊張素的增壓活性，可用于防治腎性高血壓及由長時間壓迫腎動脈所致的血壓升高．Mirian等［49］對從美洲矛頭蝮蛇毒中提取出的舒緩激肽增強肽(BPP)的功能進行了研究，發(fā)現(xiàn)這些活性肽不僅抑制激肽酶Ⅱ，增加毛細血管通透性，還能抑制血漿中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，在高血壓治療中起到積極的作用．福建產(chǎn)圓斑蝰蛇［50］、眼鏡蛇［51］等蛇毒中均有降壓活性非常明顯的組分．

3．5 抗腫瘤作用

蛇毒抗腫瘤的作用主要有以下幾個方面:1)直接殺傷腫瘤細胞;2)蛇毒酶的細胞毒素通過破壞腫瘤細胞膜、干擾膜運轉(zhuǎn)機制、與膜受體結(jié)合而殺傷腫瘤細胞;3)抑制腫瘤組織內(nèi)的血管再生［52］;4)破壞細胞周期監(jiān)控機制［8］．臨床上運用

細胞毒素進行抗腫瘤治療的較多．研究表明，細胞毒素對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞具有溶解作用［53］．利用蛇毒治療癌癥的研究，國內(nèi)外都已經(jīng)進行了長期的工作．Premzl等［54］從蛇毒中分離出一種分泌磷脂酶Ammodytoxin(AtxC)，發(fā)現(xiàn)其可以通過交叉連接與腫瘤細胞表面的組織蛋白B結(jié)合，達到直接殺傷腫瘤細胞的效果．上海長寧區(qū)新樂地段醫(yī)院用蛇毒膠囊治療各種癌癥，蛇毒膠囊中含有眼鏡蛇毒和蝮蛇毒，據(jù)報道有使腫塊縮小、延長病人生存期等療效［5］．陳勁海等［55］從舟山眼鏡蛇蛇毒中分離得到蛇毒組分，探討了不同組分的抑制腫瘤作用．張及祿等［56］成功地利用有機溶劑沉淀和凝膠過濾色譜法從長白山巖棲蝮蛇蛇毒中分離純化了一個中小分子多態(tài)Saxis，對宮頸癌細胞Hela、肝癌細胞 SMMC-7721和胃腺癌細胞SGC-7901的生長具有明顯的抑制作用，但其抑制腫瘤細胞生長和導致細胞凋亡的機制還有待于進一步研究．

蛇毒在醫(yī)藥領域中確有很大的利用價值，是極為珍貴的藥物原料．隨著蛇毒研究的不斷深入，今后蛇毒的用途將越來越廣泛．

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