RT-PCR技術(shù)檢測VFMRNA在妊娠期糖尿病中的應(yīng)用

季澤葉

本研究對妊娠晚期的妊娠期糖尿病孕婦及糖耐量正常孕婦大網(wǎng)膜組織中VFmRNA表達(dá)變化進(jìn)行檢測，旨在為探索GDM病因及VF的分子學(xué)作用機(jī)制提供進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選擇我院產(chǎn)科行產(chǎn)前檢查并行剖宮產(chǎn)術(shù)終止妊娠的妊娠36～40周、單胎、初產(chǎn)婦共200例，合并有T1DM或T2DM、妊娠期高血壓疾病、肝腎疾病、甲狀腺疾病和多囊卵巢綜合征者除外。孕婦均在孕24～28周行50 g葡萄糖負(fù)荷試驗，服糖后1h血糖水平＞7.78mmol／L者為陽性，陽性者進(jìn)一步行口服葡萄糖耐量試驗，依據(jù)美國糖尿病學(xué)會GDM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。若OGTY各時間點(diǎn)的結(jié)果中兩項或兩項以上高于正常診斷值為GDM(GDM組90例)；50g葡萄糖負(fù)荷試驗及 OGTI結(jié)果均正常者診斷為NGT(NGT組110例)。兩組孕婦年齡、孕周等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及空腹血糖、空腹胰島素、血脂水平測定：晨起抽取空腹肘靜脈血 5ml，1h內(nèi)分離血清，-80℃保存待測。血漿葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG)水平。試劑盒及全自動生化分析儀由瑞士羅氏公司提供；化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定空腹胰島素(FINS)水平，試劑盒及全自動生化分析儀由美國DPC公司提供；酶法測定總膽固醇(Tc)及甘油三酯(TG)水平，試劑盒及全自動生化分析儀由寧波亞太生物技術(shù)有限公司提供。實驗按說明書步驟進(jìn)行。采用穩(wěn)態(tài)模型(HOMA)計算IR指數(shù)(HOMA—IR)，計算方法為FBG×FINS／22.5。

1.2.2 半定量 RT—PCR技術(shù)檢測大網(wǎng)膜 vFmRNA表達(dá)

采用TRIzol(美國MRC公司產(chǎn)品)提取總RNA。參照RT—PCR試劑盒(日本TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng).以肌動蛋白(13-actin)為內(nèi)參照，預(yù)擴(kuò)增片段為589bp。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)和分析軟件進(jìn)行半定量分析，用 VF與-actin的灰度值比值表示VFmRNA的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有變量在統(tǒng)計學(xué)分析前首先進(jìn)行正態(tài)檢驗，對總體不符合正態(tài)分布的變量，采用非參數(shù)檢驗中的 Kruskal-wallisH檢驗進(jìn)行組間均數(shù)比較；對總體符合正態(tài)分布的變量采用方差分析。采用Pearson進(jìn)行相關(guān)分析。統(tǒng)計學(xué)分析所用軟件包為SPSS12.0系統(tǒng)。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦大網(wǎng)膜組織VFmRNA的表達(dá)

GDM組大網(wǎng)膜組織 VFmRNA表達(dá)水平為 0.8±0.4，NGT組表達(dá)水平為 0.5±0.3，GDM 組vFmRNA表達(dá)水平高于NGT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 大網(wǎng)膜組織 VFmRNA表達(dá)水平與各指標(biāo)的相關(guān)性

大網(wǎng)膜組織中，VFmRNA的表達(dá)水平與孕前BMI呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.32，P＜0.01)，而與其他各指標(biāo)及HOMA—IR無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討論

近年來的研究表明，脂肪組織不僅是機(jī)體儲存能量的場所，還是功能活躍的內(nèi)分泌器官，可分泌多種脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等。目前認(rèn)為，許多脂肪因子及多肽在肥胖、胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

VF是新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，具有類胰島素樣作用。對VF進(jìn)行基因測序結(jié)果顯示，其cDNA片段編碼與前B細(xì)胞集落促進(jìn)因子(PBEF)相符合，其中以 2400bp的 mRNA含量最高。VF基因位點(diǎn)在BMI、高密度脂蛋白膽固醇、TG等 IR綜合征相關(guān)表型的連鎖基因區(qū)域內(nèi)，故被認(rèn)為是影響肥胖相關(guān)表型或糖、脂代謝的候選基因。同時，這個區(qū)域還有另一重要基因——磷酸肌醇 3激酶，它可通過胰島素／胰島素樣生長因子信號傳導(dǎo)旁路影響葡萄糖及脂肪代謝。PBEF主要在骨髓、肝臟、肌肉以及有活性的淋巴細(xì)胞中高表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在 6～12周內(nèi)迅速肥胖的他DM模型鼠在逐漸肥胖的過程中，內(nèi)臟脂肪組織中VF mRNA表達(dá)水平升高，而皮下脂肪組織和肝臟中VF mRNA表達(dá)水平較低，認(rèn)為VF主要在內(nèi)臟脂肪組織中大量表達(dá)。

VFmRNA的表達(dá)受基因、激素、脂肪因子等多種因素的調(diào)節(jié)。Btittche等在對高加索人的研究中，鑒定出7個單核苷酸多態(tài)性(SNP)和1個插Ⅳ缺失，并對其中3個SNP在研究人群中進(jìn)行了基因型鑒定，未發(fā)現(xiàn)任何 SNP或單體型與空腹血漿 VF水平或12DM相關(guān)，但研究者發(fā)現(xiàn)，皮下和(或)內(nèi)臟脂肪組織 VFmRNA表達(dá)的比例與這 3個基因多態(tài)性均有關(guān)，并且其中 1個基因多態(tài)性在非糖尿病個體中與餐后2h血糖及FINS水平顯著相關(guān)，故認(rèn)為VF的基因變異可能在皮下和(或)內(nèi)臟脂肪組織 mRNA的表達(dá)中發(fā)揮一定作用，但在肥胖或眩 DM 發(fā)牛中的作用可能較小。在體外培養(yǎng)的3B—Ll脂肪細(xì)胞中，地塞米松可以上調(diào)VF的表達(dá)一致。研究表明，羅格列酮等藥物可增加內(nèi)臟脂肪組織 VF等脂肪因子的表達(dá)，從而降低血糖水平。

流行病學(xué)及動物實驗證明，內(nèi)臟性肥胖是心血管疾病的高危因素。研究表明，隨著血糖水平的升高，內(nèi)臟及皮下脂肪釋放的VF增加，血中VF水平上升，VFmRNA表達(dá)也增強(qiáng)。Berndt等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪組織VFmRNA的表達(dá)與BMI有明顯相關(guān)性，皮下脂肪組織VFmRNA表達(dá)與BMI無相關(guān)性(P＞0.5)。內(nèi)臟脂肪組織VFmRNA表達(dá)與FINS呈明顯正相關(guān)關(guān)系，但調(diào)整BMI后則無相關(guān)性(P=0.7)。本研究結(jié)果顯示，晚期妊娠婦女大網(wǎng)膜組織VFmRNA表達(dá)水平在GDM孕婦中明顯升高，可能的原因有：①由于GDM孕婦體內(nèi)靶組織對VF的敏感性下降，為代償性降低血糖水平而使大網(wǎng)膜組織VFmRNA表達(dá)增加；②GDM 作為一種炎癥狀態(tài)，其血液和組織中腫瘤壞死因子儀及白細(xì)胞介素6(IL-6)水平升高，而這些炎癥因子可上調(diào) VF mRNA的表達(dá)。故我們認(rèn)為，VF mRNA表達(dá)與GDM及肥胖密切相關(guān)，因而可將VF mRNA表達(dá)水平作為GDM發(fā)病的預(yù)測因素，此外，進(jìn)一步的研究證明，VF是獨(dú)立于胰島素而起降糖作用的脂肪因子，這也符合Fukuhara等運(yùn)用競爭性組化配位測定法發(fā)現(xiàn)VF與胰島素受體的結(jié)合位點(diǎn)不同于胰島素，是完全獨(dú)立于胰島素的作用途徑的結(jié)果。

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