重癥肌無力患者外周血單個核細(xì)胞中KLF4、RORγt與miR-206水平變化的臨床意義

王加平，朱繼平，孟曉波，梅　燕，秦文敬

(江蘇省連云港市東?？h人民醫(yī)院檢驗科　222300)

·論著·

重癥肌無力患者外周血單個核細(xì)胞中KLF4、RORγt與miR-206水平變化的臨床意義

王加平，朱繼平，孟曉波，梅燕，秦文敬

(江蘇省連云港市東?？h人民醫(yī)院檢驗科222300)

摘要:目的檢測重癥肌無力患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4(KLF4)、孤兒核受體γt(RORγt)、microRNA-206的表達(dá)水平，探討它們在重癥肌無力患者發(fā)病中的作用。方法采集重癥肌無力患者及健康對照者清晨空腹外周血標(biāo)本，梯度離心得到人PBMC。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測PBMC中KLF4、RORγt mRNA、microRNA-206的相對表達(dá)量。結(jié)果重癥肌無力患者PBMC中KLF4 mRNA為0.594±0.181，健康對照者為0.089±0.025；重癥肌無力患者PBMC中RORγt mRNA表達(dá)水平為0.570±0.266，健康對照者為0.067±0.016,重癥肌無力患者均顯著高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。重癥肌無力患者PBMC中microRNA-206表達(dá)水平為0.053±0.018，健康對照者為0.134±0.056，重癥肌無力患者顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。重癥肌無力患者PBMC中KLF4、RORγt相對表達(dá)量與microRNA-206表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.675，P<0.05,r=-0.806，P<0.05)。結(jié)論重癥肌無力患者PBMC 中KLF4mRNA、RORγtmRNA的表達(dá)水平增高及microRNA-206表達(dá)水平下降，和疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系。

關(guān)鍵詞:重癥肌無力；單個核細(xì)胞；鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4；孤兒核受體γt；microRNA-206

重癥肌無力(MG) 是一種以胸腺為靶器官的自身免疫性疾病[1]。有研究表明，輔助性T細(xì)胞17(Th17)參與MG的發(fā)病，Th17是近年來新命名的一類輔助性CD4+T細(xì)胞亞群，其具有獨特的分化途徑和轉(zhuǎn)錄因子(RORγt)，以能夠誘導(dǎo)編碼白細(xì)胞介素-17(IL-17)的下游基因表達(dá)為主要特征[2-3]。鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4(KLF4)是一種含鋅指修飾結(jié)構(gòu)的蛋白，是Th17分化的正調(diào)節(jié)因子[4-5]。MicroRNA(miRNA) 是一類短的非編碼RNA，大約20～22個核苷酸，介導(dǎo)RNA干擾并且在翻譯水平抑制蛋白表達(dá)。已經(jīng)證實人類KLF4是miR-206的靶分子之一[6]。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 檢測MG患者人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中KLF4、RORγt mRNA和miR-206的表達(dá)水平，并分析KLF4、RORγt 與miR-206表達(dá)的相關(guān)性，探討這幾個因素在MG發(fā)病中的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2012年1月至2015年6月在本院經(jīng)臨床確診的MG患者27例，選擇的MG病例根據(jù)典型的臨床癥狀、新斯的明試驗陽性或神經(jīng)重復(fù)電刺激遞減試驗陽性確診[7],其中男16例，女11例，平均年齡(49±14)歲；健康對照組選擇本院體檢中心健康體檢者20例，其中男13例，女7例，平均年齡(51±9)歲，均無近期感染或自身免疫病史。兩組研究對象之間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑實時熒光PCR儀為美國伯樂CFX 96型，F(xiàn)icoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液從天津灝陽生物制品有限公司采購,淋巴細(xì)胞刺激劑佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)從Sigma公司采購。上海生工合成PCR引物、Trizaol和SYBR Green購自Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理清晨采取研究對象空腹靜脈血3～5 mL，肝素鈉抗凝，采用Ficoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液梯度離心獲得人PBMC，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106/mL，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,放置在含有PMA(50 ng/mL)和Ionomycin (1.0 μg/mL)RPMI-1640的培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和溫度條件下溫育5 h后，收集細(xì)胞。

1.3.2樣本中KLF4、RORγt mRNA及miR-206相對表達(dá)量檢測從將PBMCs刺激5 h后收集的細(xì)胞中提取總mRNA。按照TOYOBO試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。新合成的cDNA置于-20 ℃冰箱中備用。采用CFX 96實時熒光PCR儀按照Bio-Rad SYBR Green Super Mix 說明書進(jìn)行檢測。所用引物序列為：KLF4上游引物為5′-CAA GTC CCG CCGCTC CAT TAC CAA-3′，下游引物為5′-CCA CAG CCG TCC CAG TCA CAG TGG-3′；RORγt上游引物為5′-CCT GGG CTC CTC GCC TGA CC-3′，下游引物為 5′-TCT CTC TGC CCT CAG CC TTG CC-3′；β-actin上游引物為5′-CAC GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3′，下游引物為5′-CAT ACT CCT GCT TGC TGA TC-3′，以β-actin為參照進(jìn)行校準(zhǔn)；miR-206上游引物為5′-GAG TGC TGG AAT GTA AGG AAG-3′，下游引物為5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3′，以small nuclear-RNA即snRNA為參照。每份標(biāo)本同時采用相同反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測，PCR擴增3次。

2結(jié)果

2.1MG患者與健康對照組PBMC 中KLF4、RORγt mRNA及miR-206表達(dá)水平比較見表1。MG患者PBMC 中KLF4 和RORγt mRNA相對表達(dá)量顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.563、7.552,P<0.05)，miR-206相對表達(dá)量顯著低于健康對照組，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.579,P<0.05)。

表1　　兩組PBMC 中KLF4 mRNA、RORγt mRNA和

注：與健康對照組比較，*P<0.05。

2.2MG患者PBMC 中KLF4和RORγt相關(guān)性分析見圖1。對MG患者PBMC 中KLF4和RORγt mRNA相對表達(dá)量的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析，圖1顯示KLF4與RORγt之間呈正相關(guān)(r= 0.705，P<0.05)。

圖1　MG患者PBMC 中KLF4和RORγt mRNA

2.3MG患者PBMC 中KLF4、RORγt與miR-206的相關(guān)性分析見圖2、3。采用直線相關(guān)分析MG患者PBMC 中KLF4和RORγt mRNA分別與miR-206相對表達(dá)量的相關(guān)性，圖2、3結(jié)果顯示，KLF4和RORγt mRNA與miR-206的表達(dá)水平之間均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.675、-0.806，P<0.05)。

圖2　MG患者PBMC中KLF4與miR-206

圖3　MG患者PBMC 中RORγt mRNA與miR-206

3討論

MG是一種自身免疫性疾病，以T細(xì)胞輔助、抗體介導(dǎo)、補體參與的神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙為特征，有研究結(jié)果表明，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞參與MG誘導(dǎo)和發(fā)病過程[1]。Th17是一類與Th1和Th2不同的CD4+T細(xì)胞新亞群,這類細(xì)胞主要以分泌IL-17而得名[7-8]。RORγt是Th17特異性的主要轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控IL-17的分泌[2]。有研究表明，Th17細(xì)胞數(shù)目上調(diào)可導(dǎo)致免疫耐受失衡，引發(fā)MG等自身免疫性疾病發(fā)病[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，MG患者外周血Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)呈顯著性增高，由此提示Th17與MG的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

KLF家族是真核生物中一大類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，在真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中起重要作用[9]。KLF4是其家族中目前研究最多的一員，包含3個結(jié)構(gòu)域:高度保守的C-端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、高度可變的N-端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域及核定位序列[10]。KLF4能結(jié)合靶基因富含Gc的啟動子序列，促進(jìn)或抑制下游基因表達(dá)，KLF4對Th17的分化具有正調(diào)節(jié)作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，在MG患者PBMC中KLF4 mRNA的表達(dá)也顯著增高，而且與RORγt mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.705，P<0.05)。本研究結(jié)果提示，MG患者PBMC中KLF4 mRNA可以通過促進(jìn)RORγt活性進(jìn)而上調(diào)Th17表達(dá)，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。

miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。它通過與靶基因的3′UTR結(jié)合繼而抑制靶基因的表達(dá)[11]。人類的外周血中KLF4是miR-206的靶分子之一[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，MG患者PBMC中miR-206表達(dá)下降，相反KLF4 mRNA表達(dá)水平卻呈升高狀態(tài)，二者呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.675，P<0.05)，并且miR-206與RORγt mRNA表達(dá)也表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.806，P<0.05)，這可能是由于miR-206的低表達(dá)從而上調(diào)了KLF4 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)RORγt mRNA的高表達(dá)，從而使MG患者PBMC中Th17比例增高。

本研究結(jié)果表明，MG患者PBMC中miR-206的表達(dá)下降可在一定程度使KLF4 mRNA表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步促使RORγt mRNA表達(dá)增強，最終提高了Th17水平，促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展，相關(guān)的分子機制還需進(jìn)一步研究。

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The significance of the levels of KLF4,RORγt,microRNA-206 in peripheralblood mononuclear cells of patients with myasthenia gravis

WANGJiaping,ZHUJiping,MENGXiaobo,MEIYan,QINWenjing

(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofDonghaiCounty,Lianyungang,Jiangsu222300,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the expression levels of Kruppel-like factor 4 (KLF4),orphan nuclear receptor gamma t (RORγt) and microRNA-206 (miR-206) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with myasthenia gravis(MG) and to explore the effects of these indicators on the pathogenesis of MG.MethodsFasting blood samples from patients with MG and healthy controls were collected in the morning.PBMCs were isolated by standard density-gradient centrifugation over Ficoll-Hypaque solution in all the subjects.The expression levels of KLF4,RORγt mRNA and microRNA-206 were extracted from PBMCs which were stimulated by phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and ionomycin,and then the mRNAs was transcribed reversely into cDNA.The expression levels of KLF4,RORγt mRNA and microRNA-206 were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR).ResultsThe level of KLF4 in the patients with MG 0.594±0.181 was significantly higher than that of healthy controls 0.089±0.025(P<0.05) and the level of RORγt in the patients with MG 0.570±0.266 was also significantly higher than that of healthy controls 0.067±0.016(P<0.05).The expression level of miR-206 in the patients of MG 0.053±0.018 was significantly lower than that of the healthy controls 0.134±0.056(P<0.05).In addition,the expression levels of KLF4 (r=-0.675,P<0.05) and RORγt (r=-0.806,P<0.05) were negatively correlated with the level of miR-206 in MG patients.Conclusion The increased expression levels of KLF4 and RORγt and decreased expression level of miR-206 may be closely correlated with the occurrence and development of MG.

Key words:myasthenia gravis;mononuclear cells;kruppel-like factor 4;RORγt;microRNA-206

作者簡介：王加平，女，副主任技師，主要從事臨床免疫檢驗研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.020

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1500-03

(收稿日期：2016-01-13修回日期：2016-03-29)