基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在病原真菌檢驗中的應用進展

張超 廖萬清

(上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所 全軍真菌病重點實驗室 第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑在臨床的廣泛使用，導管插管、腹膜透析、放射治療等大量開展，尤其是人類免疫缺陷病毒 (HIV)感染者的不斷增多，真菌病已成為影響人類生活質(zhì)量、威脅生命健康的重要疾病之一。鏡檢和培養(yǎng)是臨床實驗室最常規(guī)的真菌檢測方法，然而，鏡檢的陽性率較低，培養(yǎng)會受到時間及實驗室人員技術(shù)水平的限制。分子生物學技術(shù)鑒定臨床分離真菌方法多樣，包括DNA中G+C mol%含量測定、核酸雜交技術(shù)、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析、電泳核型分析、隨機擴增多態(tài)性DNA分析、rDNA ITS序列分析等，不同方法之間各有優(yōu)勢和不足，仍在不斷完善中［1］。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)是一種可用于檢測大分子物質(zhì)的“軟電離”質(zhì)譜分析技術(shù)。近年來，該技術(shù)在致病性微生物尤其是細菌的研究中被證實是一種準確、快速、經(jīng)濟的檢驗方法［2-4］。隨著 MALDI-TOF MS技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，

其在致病性真菌研究中的作用也日顯突出，現(xiàn)就該技術(shù)在病原真菌研究中的應用進展作一綜述。

1 MALDI-TOF MS應用于微生物檢驗的基本原理

20世紀80年代后期，基質(zhì)輔助激光解析電離(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI)和電噴霧電離 (Electrospray ionization，ESI)兩種“軟電離”技術(shù)在質(zhì)譜領域的應用，開創(chuàng)了質(zhì)譜技術(shù)研究生物大分子的局面［5-7］。MALDI-TOF MS的基本原理［8］:當用一定波長的激光照射由基質(zhì)和樣品形成的共結(jié)晶薄膜時，基質(zhì)吸收激光能量而汽化，并迅速降解，樣品解吸附，基質(zhì)和樣品間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移從而使樣品分子發(fā)生電離，樣品離子在電場的作用下在飛行時間質(zhì)量分析器 (time-of-flight analyzer，TOF)中加速飛行，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同可計算不同離子的質(zhì)荷比，從而對物質(zhì)進行定性或定量的分析。由于基質(zhì)的使用，樣品不會因為過強的激光能量導致大分子物質(zhì)被破壞，因此被稱為“軟電離”方式。

由于不同菌種或菌株的微生物表達的蛋白質(zhì)不同，利用MALDI-TOF MS技術(shù)分析得到的質(zhì)譜也是不同的，因此能夠利用這些MALDI-TOF MS質(zhì)譜“指紋”和與之前收集的數(shù)據(jù)庫中的參考“指紋”圖譜對比，從而鑒定包括細菌和真菌在內(nèi)的各種微生物。

2 MALDI-TOF MS應用于真菌檢驗的現(xiàn)狀

在致病性細菌研究方面，MALDI-TOF MS已在食源性致病菌、植物病原細菌、臨床致病菌及其耐藥性等方面進行了廣泛研究［9］。MALDI-TOF MS對真菌進行檢測的研究相對較晚，2000年，Welham 等［10］首次對 MALDI-TOF MS 技術(shù)在青霉、小柱孢菌和紅色毛癬菌等真菌檢測中的應用進行了初步研究。之后很多學者對MALDI-TOF MS在致病性酵母菌和絲狀真菌檢測中的準確性、檢測條件以及應用范圍等方面進行了更為深入的研究。

2.1 MALDI-TOF MS在酵母菌檢測中的應用

Putignani［11］等對 303 株臨床分離的酵母菌和酵母樣菌進行MALDI-TOF MS檢測，與傳統(tǒng)方法鑒定符合率為84.8%，經(jīng)基因分型校正后，鑒定準確率為91.7%，其中20株由于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)缺乏而未得到鑒定。Seyfarth等［12］用MALDITOF MS與API ID 32 C系統(tǒng)兩種方法檢測83株酵母菌，二者準確率分別為94%和84.3%，而MALDI-TOF MS參考數(shù)據(jù)庫的更新相比API要方便許多。2011年，McTaggart等［13］對 160株酵母菌，包括137株隱球菌和23株非隱球菌進行了MALDI-TOF MS檢測，鑒定到種水平的準確率為100%，而新生隱球菌鑒定到亞種水平的準確度也高達85/86(98.8%)。2012年，F(xiàn)iracative等［14］利用 MALDI-TOF MS 技術(shù)對 164株新生隱球菌和格特隱球菌進行檢測，能夠100%準確鑒定到種，而且能夠區(qū)分8個主要的分子類型 (新生隱球菌VNⅠ-VNⅣ，格特隱球菌VGⅠ-VGⅣ)。另外，他們還利用該技術(shù)成功鑒定出了四株新生隱球菌與格特隱球菌的種間雜交株。Pinto等［15］在沒有向參考數(shù)據(jù)庫中增加新菌株的情況下利用MALDI-TOF MS技術(shù)共檢測了264株酵母菌。在對167株酵母菌的回顧性研究中，鑒定到屬和種的準確率分別為96%和84%。在對67株酵母菌進行的前瞻性研究中，鑒定到種水平的菌株為53株 (79%)，準確度等同于形態(tài)學方法，而除了4株新生隱球菌沒有得到準確鑒定外，其他菌株均準確鑒定到屬的水平。在該項研究中，新生隱球菌的檢測準確度很低，僅為1/6(17%)，這與McTaggart等［13］的研究結(jié)果相差較大，可能與該研究直接應用商品化數(shù)據(jù)庫有關(guān)。張明新等［16］對60株臨床分離的酵母菌研究時，用MALDI-TOF MS鑒定的結(jié)果與Vitek compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)比對，鑒定符合率為95%(57/60)，他們認為質(zhì)譜分析前準備階段是鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中培養(yǎng)條件和菌落處理溶劑是重要影響因素。

2.2 MALDI-TOF MS在絲狀真菌檢測中的應用

由于絲狀真菌具有多種形態(tài)如菌絲、分生孢子等，使得蛋白質(zhì)譜可能會因真菌的生長狀況和樣品部位的不同而發(fā)生變化，因此MALDI-TOF MS對絲狀真菌的檢測相對落后于細菌和酵母菌，但近年來亦有不少學者對此進行了從基礎到臨床應用方面的研究。

Alshawa等［17］對360株臨床分離的皮膚癬菌和21株小柱孢屬菌進行MALDI-TOF MS檢測，鑒定到種的準確率分別為331/360(91.9%)和18/21(85.7%)，27株皮膚癬菌和3株小柱孢屬菌沒有得到鑒定是因為沒有獲得質(zhì)譜信號，而只有2株 (0.5%)皮膚癬菌鑒定錯誤。同樣是對黃曲霉和寄生曲霉進行MALDI-TOF MS檢測，Hettick［18］和 Li［19］兩位學者做出的質(zhì)譜圖雖然相似，但也有差別，Li的報告結(jié)果中m/z峰要比Hettick的少，這種差異可能是與Hettick對樣品進行了微珠渦流法進行破壁處理有關(guān)。Hettick［20］還利用MALDI-TOF MS對青霉屬進行了研究，他們對12種青霉進行了檢測，結(jié)果全部鑒定到種的水平。他們的研究中得到的產(chǎn)黃青霉、橘青霉和擴展青霉三種青霉的質(zhì)譜“指紋”圖譜的峰值大都分布在 m/z 10 000 ～20 000，而Chen等［21］得到的峰值卻分布于m/z 3 000附近，產(chǎn)生如此大差別可能是由于設備 (反射式TOF與線性TOF)、培養(yǎng)基、樣品處理方式(全細胞與微珠渦流法)以及MALDI介質(zhì)的不同所致，這也說明對MALDI-TOF MS進行真菌檢測的方法學標準化十分必要。

Coulibaly［22］等對 MALDI-TOF MS 鑒定波氏假阿利什菌(尖端賽多孢子菌)的條件進行了研究。他們用22株標準株對培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間以及蛋白提取方法的研究發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)基和蛋白提取方法對檢測結(jié)果沒有影響，沙氏培養(yǎng)基以及蟻酸即可用于培養(yǎng)菌株和蛋白提取;隨著培養(yǎng)時間的延長，鑒定準確度會增高，但72 h已經(jīng)足夠鑒定出菌株。Marinach-Patrice［23］等對臨床分離的 62 株鐮刀菌進行了MALDI-TOF MS鑒定，其中57株 (92%)鑒定到種，4株由于數(shù)據(jù)庫中缺少參考菌種沒有得到鑒定。此外，通過對培養(yǎng)條件的研究，他們認為最佳的培養(yǎng)基為麥芽瓊脂或者馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)溫度為27℃，最佳培養(yǎng)時間為72 h，傳代培養(yǎng)在小于11次的情況下質(zhì)譜不會發(fā)生改變。

Chierico［24］等對 20 種共 230 株絲狀真菌進行了MALDI-TOF MS鑒定，他們分別對培養(yǎng)了48 h、72 h、96 h和120 h的菌落進行檢測，準確率隨著時間的延長而增加，為36.4%、50.0% 、77.3% 和 85.9%，培養(yǎng) 120 h是進行 MALDITOF MS鑒定比較理想的時間。Cassagne等［1］對絲狀真菌的鑒定給出了標準化的檢測程序。通過實驗對比，他們最終選擇沙氏培養(yǎng)基做菌落培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為72 h，蟻酸作為真菌蛋白質(zhì)提取 試 劑，α-氰 基-4-羥 基 肉 桂 酸 (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA)作為基質(zhì)。利用該程序?qū)儆?3個菌種的177株絲狀真菌進行鑒定，其中154株 (87%)得到準確鑒定;另外23株中，只有2株鑒定錯誤，21株是因為參考數(shù)據(jù)庫中缺乏相應的菌種。如果進一步增加參考數(shù)據(jù)庫的菌種種類，MALDI-TOF MS完全可以用于臨床實驗室的常規(guī)診斷。

3 MALDI-TOF MS應用于真菌檢驗的優(yōu)勢與不足

MALDI-TOF MS是一種準確、快速、高通量、成本相對較低的新型真菌檢測方法。所測菌株需要培養(yǎng)3～7 d，每份樣品制備大約需要20 min，而且能夠一次性檢測十幾個菌株，而常規(guī)的形態(tài)學檢測則通常至少需要1周。耗材和試劑的花費每份樣品大約3.5元，盡管主要設備需要約140萬元，但其運行成本較低，綜合成本要相對傳統(tǒng)鑒定方法低［13］。

目前MALDI-TOF MS存在的主要問題是數(shù)據(jù)庫的不完善，數(shù)據(jù)庫為公司所有，未能像核酸數(shù)據(jù)庫BLAST那樣免費面向公眾。臨床菌株的質(zhì)譜和商品化的數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜可能存在一定的差異，同一真菌在不同地區(qū)的分離株可能存在表型甚至基因結(jié)構(gòu)的不同，因此不同國家和地區(qū)的實驗室利用MALDI-TOF MS鑒定真菌時尚需同時參考根據(jù)本地區(qū)的菌株建立的數(shù)據(jù)庫和商品化數(shù)據(jù)庫。此外，MALDI-TOF MS還不能直接從體液以及其他組織中直接檢測真菌的存在，進行質(zhì)譜分析前分離培養(yǎng)仍是不可缺少的步驟［25］。另外，培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間以及各種可能影響到檢測結(jié)果的因素尚需標準化［26］。

4 展 望

MALDI-TOF MS是一種簡單、快速、高通量、成本相對較低的有效檢測技術(shù)。該方法是對傳統(tǒng)微生物檢測方法的補充，為真菌鑒定提供了新的選擇。目前已經(jīng)有學者著手建立針對微生物MALDI-TOF MS鑒定的免費網(wǎng)上質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫［27］，相信隨著網(wǎng)上質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立和不斷完善，MALDI-TOF MS技術(shù)在真菌以及其他微生物檢測等方面的應用將會更加廣泛。

［1］Cassagne C，Ranque S，Normand AC，et al.Mould Routine I-dentification in the Clinical Laboratory by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry［online］.Available:www.plosone.org.

［2］Mellmann A，Cloud J，Maier T，et al.Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry in Comparison to 16S rRNA Gene Sequencing for Species I-dentification of Nonfermenting Bacteria［J］.J Clin Microbiol，2008，46(6):1946-1954.

［3］Saffert RT，Cunning SA，Ihde SM，et al.Comparison of Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer to BD Phoenix automated microbiology system for identification of gram-negative bacilli［J］.J Clin Microbiol，2011，49(3):887-892.

［4］Seng P，Drancourt M，Gouriet F，et al.Ongoing revolution in bacteriology:routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry［J］.Clin Infect Dis，2009，49(4):543-551.

［5］Tanaka K，Waki H，Ido Y，et al.Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，1988，2(8):151-153.

［6］Fenn JB，Mann M，Meng CK，et al.Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules［J］.Science，1989，246(4926):64-71.

［7］何英，陸學東.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)及其在臨床微生物鑒定中的應用［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2011，34(10):881-888.

［8］Croxatto A，Prod＇hom G，Greub G.Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology［J］.FEMS Microbiol Rev，2012，36(2):380-407.

［9］吳婕，張萍.基質(zhì)輔助激光解析-飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)在致病性細菌研究中的應用［J］.儀器儀表與分析監(jiān)測，2010，2:1-4.

［10］Welham KJ，Domin MA，Johnson K，et al.Characterization of fungal spores by laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2000，14(5):307-310.

［11］Putignani L，Chierico FD，Onori M，et al.MALDI-TOF mass spectrometry proteomic phenotyping of clinically relevant fungi［J］.Mol Biosyst，2011，7(3):620-629.

［12］Seyfarth F，Wiegand C，Erhard M，et al.Identification of yeast isolated from dermatological patients by MALDI-TOF mass spectrometry［J］.Mycoses，2012，55(3):276-280.

［13］McTaggart LR，Lei E，Richardson SE，et al.Rapid Identification ofCryptococcus neoformansandCryptococcus gattiiby Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry［J］.J Clin Microbiol，2011，49(8):3050-3053.

［14］Firacative C，Trilles L，Meyer W.MALDI-TOF MS Enables the Rapid Identification of the Major Molecular Types within theCryptococcus neoformans/C.gattiiSpecies Complex［J］.PLoS ONE，2012，7(5):e37566.

［15］Pinto A，Halliday C，Zahra M，et al.Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry Identification of Yeasts Is Contingent on Robust Reference Spectra［online］.Available:www.plosone.org.

［16］張明新，朱敏，王玫，等.應用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒定常見細菌和酵母菌［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2011，34(11):988-992.

［17］Alshawa K，Beretti JL，Lacroix C，et al.Successful Identi?cation of Clinical Dermatophyte and Neoscytalidium Species by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry［J］.Journal of Clinical Microbiology，2012，50(7):2277-2281.

［18］Hettick JM，Green BJ，Buskirk AD，et al.Discrimination of Aspergillus isolates at the species and strain level by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting［J］.Analytical Biochemistry，2008，380(2):276-281.

［19］Li TY，Liu BH，Chen YC.Characterization of Aspergillus spores by matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2000，14(24):2393-2400.

［20］Hettick JM，Green BJ，Buskirk AD，et al.Discrimination of Penicillium isolates by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2008，22(16):2555-2560.

［21］Chen HY，Chen YC.Characterization of intact Penicillium spores by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2005，19(23):3564-3568.

［22］Coulibaly O，Marinach-Patrice C，Cassagne C，et al.Pseudallescheria/Scedosporium complex species identification by matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry［J］.Med Mycol，2011，49(6):621-626.

［23］Marinach-Patrice C，Lethuillier A，Marly A，et al.Use of mass spectrometry to identify clinical Fusarium isolates［J］.Clin Microbiol Infect，2009，15(7):634-642.

［24］Del Chierico F，Masotti A，Onori M，et al.MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin［J］.J Proteomics，2012，75(11):3314-3330.

［25］Wieser A，Schneider L，Jung J.MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond(mini review)［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93(3):965-974.

［26］Croxatto A，Prod＇hom G，Greub G.Applications of MALDITOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology［J］.FEMS Microbiol Rev，2012，36(2):380-407.

［27］Bhme K，F(xiàn)ernández-No IC，Barros-Velázquez J，et al.Spectra-Bank:An open access tool for rapid microorganism identification by MALDI-TOF MS fingerprinting［online］.Available:http://handle.digital.csic.es/bitstream/10261/51598/1/SpectraBank_open_access_tool.pdf［Accepted Article］.