用HPLC－MS／MS法同時(shí)測(cè)定Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中嗎替麥考酚酯和麥考酚酸的濃度

余自成，江 濤，瞿江媛，田薇薇，馬明華，陳紅君，陳紅專

（1.上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院臨床藥學(xué)和藥理學(xué)研究室，上海200090；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海200025）

嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）是一種重要的免疫抑制藥物，已獲準(zhǔn)用于預(yù)防腎臟、肝臟和心臟移植器官排異反應(yīng)，作為免疫抑制首選藥物在臨床廣泛應(yīng)用［1］。MMF為前體藥物，口服給藥后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚援a(chǎn)物麥考酚酸（mycophenolic acid，MPA），發(fā)揮免疫抑制作用。本研究建立了HPLC－MS／MS法同時(shí)測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中MMF和 MPA的濃度，用于研究MMF和MPA穿透Caco－2細(xì)胞單層的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，評(píng)價(jià)P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）在兩者腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型HPLC儀，包括Quat Pump G1311A四元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314B可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、G1322A在線真空脫氣機(jī)和G1316A柱溫箱；6410三重串聯(lián)四極桿LC／MS儀和Mass Hunter工作站軟件（美國(guó)Agilent公司）；BS224S型精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Delta 320型pH計(jì)（梅特勒－托利多儀器有限公司）；XW－80A旋渦混合器（原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；M型移液器（法國(guó)Gilson儀器有限公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品和試劑 嗎替麥考酚酯對(duì)照品（純度99.0%，德國(guó)羅氏診斷有限公司）；麥考酚酸對(duì)照品（純度99.8%，羅氏生物科技公司）；吲哚美辛對(duì)照品（純度99.2%美國(guó)Sigma－Aldrich公司）；D－葡萄糖（英國(guó)Biotech Bio Basic公司）；4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，高純度，上海生工生物工程有限公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院自制）。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制 （1）MMF儲(chǔ)備液：精密稱取MMF對(duì)照品9.4mg，加二甲亞砜（DMSO）216.8μl溶解，混勻，即得濃度為100mmol／L的MMF對(duì)照品儲(chǔ)備液。（2）MPA儲(chǔ)備液：精密稱取MPA對(duì)照品6.8mg，加DMSO 212μl溶解，混勻，即得濃度為100mmol／L的MPA對(duì)照品儲(chǔ)備液。（3）Hank平衡鹽溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS）：精密稱取CaCl2140mg、KCl 400mg、KH2PO460mg、MgCl2·6H2O 100mg、NaCl 8g、Na2HPO4、MgSO4·7H2O 100mg、NaHCO3350mg、48mg、D－葡萄糖4.5g和HEPES 5.95g，加超純水溶解并稀釋至1 000ml，用1mol／L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，分裝，置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?）吲哚美辛（內(nèi)標(biāo)）儲(chǔ)備液：精密稱取吲哚美辛對(duì)照品3.0mg，加DMSO 1.0ml溶解，搖勻，即得濃度為3mg／ml的吲哚美辛儲(chǔ)備液。精密移取吲哚美辛儲(chǔ)備液50μl，加HBSS溶液稀釋至5ml，搖勻，即得30μg／ml的吲哚美辛對(duì)照品溶液。（5）樣品溶液：取轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)樣品0.1ml，置于1.5ml塑料離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（30μg／ml）5μl，渦旋振蕩30s，混勻，吸取上清液作為樣品溶液。上述溶液均置－40℃低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件 色譜柱：Zorbax Eclipse XDB－C18柱（50mm×2.1mm，3.5μm）；流動(dòng)相：A相（甲醇，含0.05%甲酸），B相（水，含0.05%甲酸）；梯度洗脫：0～3.60min，40%A，流速：0.3ml／min，3.61～7.00min，65%A，流速：0.6ml／min，7.01～10.00min，40%A，流速：0.6ml／min；柱溫：30℃。2.3 質(zhì)譜檢測(cè)條件 采用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度100℃，毛細(xì)管電壓4.0kV，去溶劑氣溫度350℃，去溶劑氣流速9.0L／min，碰撞氣為N2，霧化氣壓力206.9kPa，離子駐留時(shí)間均為200ms。檢測(cè)方式為多種反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），用于定量分析監(jiān)測(cè)的離子反應(yīng)為MMF：m／z 433.8→194.8，離子極性為正離子，錐孔電壓150V，碰撞能量35eV；MPA：m／z319.1→191.0，離子極性為負(fù)離子，錐孔電壓165V，碰撞能量30eV；吲哚美辛：m／z 356.0→312.1，離子極性為負(fù)離子，錐孔電壓80V，碰撞能量5eV。

2.4 色譜－質(zhì)譜行為 在2.2項(xiàng)色譜條件和2.3項(xiàng)質(zhì)譜條件下，取HBSS溶液，添加MMF對(duì)照品、MPA對(duì)照品和吲哚美辛對(duì)照品的HBSS溶液，以及樣品溶液分別進(jìn)樣，在各自的離子通道上采集數(shù)據(jù)。結(jié)果MMF、MPA和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為4.16、6.38和8.49min，色譜峰形較好，能夠完全分離，色譜圖見圖1。

圖1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸的HPLC－MS／MS譜圖Figure 1 HPLC－MS／MS photograms of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 離子抑制實(shí)驗(yàn) 將MMF和MPA分別用甲醇、流動(dòng)相和HBSS溶液溶解后進(jìn)樣測(cè)定，考察離子化過程中由HBSS溶液殘留介質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的離子抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溶劑對(duì)MPA的質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)影響相似，用甲醇和流動(dòng)相溶解質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度相同，用HBSS溶液溶解較甲醇和流動(dòng)相溶解質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度略有下降，但差別不明顯，而將HBSS溶液中鹽份切換與不切換至廢液的質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度相同。但溶劑不同對(duì)MMF的質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)影響差異較大，信號(hào)強(qiáng)度由大到小依次為：流動(dòng)相＞甲醇＞HBSS溶液。用流動(dòng)相溶解，質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)約為用HBSS溶液溶解時(shí)的兩倍，而將HBSS溶液中鹽份切換至廢液可以提高檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和最低檢測(cè)濃度 用空白HBSS溶液將MMF和MPA對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋，分別配制成系列濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00μmol／L的溶液，按照樣品測(cè)定方法操作，以內(nèi)標(biāo)法定量。以MMF、MPA與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比（As／Ai）為縱坐標(biāo)，濃度（c）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。MMF和MPA在0.01～20μmol／L范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，MMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：As／Ai＝－0.035 2＋0.394 5 c（r＝0.999 1），MPA為As／Ai＝0.005 5＋0.050 8 c（r＝0.999 5）。以信噪比（S／N）≥3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得MMF和MPA的最低檢測(cè)濃度分別為0.005、0.001μmol／L。

2.5.3 精密度和回收率實(shí)驗(yàn) 用適量空白HBSS溶液將MMF和MPA對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋，配成濃度為0.10、1.50和15.00μmol／L的對(duì)照品質(zhì)控樣品，按照2.2項(xiàng)下色譜條件和2.3項(xiàng)下質(zhì)譜條件，在同一天重復(fù)測(cè)定5份，計(jì)算日內(nèi)RSD。每天測(cè)定1份，連續(xù)測(cè)定5d，計(jì)算日間RSD。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算濃度，以測(cè)得濃度與配制濃度的比值計(jì)算方法回收率。結(jié)果表明，MMF的日內(nèi)RSD＜6.02%，日間RSD＜7.27%；3種濃度的回收率分別為（103.2±7.5）%、（97.3±3.1）%和（96.0±3.4）。MPA的日內(nèi)RSD＜8.85%，日間RSD＜9.25%；3種濃度的回收率分別為（106.9±1.0）%、（106.0± 5.7）%和（108.4±3.2）（n＝5）。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將MMF和MPA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品于室溫（20℃）放置48h、37℃培養(yǎng)箱放置4h、4℃冰箱放置1周，以及－20℃冰箱放置3個(gè)月，測(cè)定濃度，評(píng)價(jià)樣品穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。

表1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability tests of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid（n＝3，±s，cB／μmol·L－1）

表1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability tests of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid（n＝3，±s，cB／μmol·L－1）

個(gè)月嗎替麥考酚酯濃度 20℃放置48h 37℃放置4h 4℃放置1周－20℃放置3 1.50 1.49±0.01 1.45±0.01 1.43±0.01 1.45±0.05 15.00 14.76±0.40 14.82±0.77 14.30±0.15 14.25±0.34麥考酚酸1.50 1.49±0.02 1.48±0.05 1.46±0.06 1.45±0.03 15.00 15.33±0.46 14.68±0.09 14.22±0.33 14.60±0.45

3 討 論

對(duì)Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)樣品的分析通常采用HPLC法［2，3］，但是這些檢測(cè)器靈敏度較低，特別是紫外檢測(cè)器對(duì)多數(shù)化合物的檢測(cè)靈敏度均不夠。MS法作為一種新的檢測(cè)技術(shù)，在藥物代謝研究中正發(fā)揮著越來越重要的作用，特別是HPLC－MS／MS法因具有更好的專屬性和靈敏度而被公認(rèn)為是目前用于生物樣品定性和定量分析最為理想的方法。研究者將HPLC－MS／MS法用于Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)樣品的分析［4，5］。本研究建立了一種具有較高靈敏度和準(zhǔn)確度的HPLC－MS／MS方法用于測(cè)定Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)樣品中MMF和MPA的濃度，MMF和MPA理化性質(zhì)差異較大。通過梯度洗脫的方法，優(yōu)化梯度條件，實(shí)現(xiàn)了在同一色譜條件下對(duì)兩者的同時(shí)檢測(cè)。本方法測(cè)定的線性范圍為0.01～20.00μmol／L，能夠包括轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中所有樣品的MMF和MPA濃度，精密度、回收率和穩(wěn)定性等均能滿足分析測(cè)定的要求。本研究使用吲哚美辛作為內(nèi)標(biāo)物，而未使用與MPA結(jié)構(gòu)相近的丁氧羧基醚化麥考酚酸（MPAC），主要原因是MPAC的離子碎片會(huì)給MMF和MPA的含量測(cè)定帶來離子污染，干擾MMF和MPA低濃度時(shí)的測(cè)定。由于對(duì)照品的量較少，本研究以對(duì)照品直接加入二甲亞砜中配制對(duì)照品儲(chǔ)備液。

轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中高濃度鹽會(huì)導(dǎo)致離子抑制作用，影響檢測(cè)靈敏度。因此，在分析測(cè)定時(shí)需要脫鹽處理，應(yīng)在樣品進(jìn)入質(zhì)譜離子源之前去除無機(jī)鹽，以避免出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)抑制及離子源污染［6］。離子抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBSS溶液中無機(jī)鹽的存在對(duì)MMF檢測(cè)有較大影響，對(duì)MPA檢測(cè)影響較小。通過軟件系統(tǒng)控制，在樣品進(jìn)入質(zhì)譜離子源之前使用切換閥可以將HBSS溶液中大部分的鹽份切換至廢液，顯著提高檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，但殘留的少量鹽份仍然會(huì)導(dǎo)致一定的離子抑制作用。因此為了獲得有關(guān)MMF、MPA穿過Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的準(zhǔn)確信息，所有樣品應(yīng)維持相同的無機(jī)鹽含量。

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