天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用*

聶 晶,杜 亮,陸遠富,石京山

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,貴州遵義 563000;2.貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室,貴州遵義 563000)

天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用*

聶 晶1,2,杜 亮2,陸遠富1,2,石京山1,2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,貴州遵義 563000;2.貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室,貴州遵義 563000)

目的探討天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用機制?方法 采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,缺血2h,再灌注24h后取大鼠大腦組織進行HE染色觀察病理改變,TUNEL法計數(shù)凋亡細胞,Real time RT-PCR檢測胱天蛋白酶3(casepase-3)mRNA的表達?結(jié)果天麻素能明顯改善中動脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病理變化,減少細胞凋亡(P0.01),降低caspase-3mRNA的表達(P0.05)?結(jié)論天麻素可通過下調(diào)caspase-3mRNA的表達減少大腦神經(jīng)細胞凋亡,對缺血再灌注損傷大鼠腦組織發(fā)揮保護作用?

天麻屬;腦缺血;再灌注損傷;細胞凋亡;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

缺血性腦血管病是一種常見病和多發(fā)病,是目前嚴重危害人類健康的主要疾病之一,因具高發(fā)病率?高死亡率?高致殘率和高復(fù)發(fā)率等特點而引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注與高度重視?腦缺血再灌注后以神經(jīng)元為主的壞死與細胞凋亡是腦損傷中重要的病理生理過程,其中細胞凋亡的重要作用日益受到重視?抑制細胞凋亡,可以減輕腦梗死的體積,這已成為缺血性腦血管病的治療靶點之一[1]?既往研究發(fā)現(xiàn)天麻素可明顯改善中動脈閉塞所致局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能,明顯縮小梗死面積,降低腦含水量,對大鼠腦缺血再灌注損傷有顯著的保護作用[2],因此,本研究擬在此基礎(chǔ)上觀察天麻素對大鼠凋亡誘導(dǎo)因子——胱天蛋白酶3(caspase-3)及神經(jīng)細胞凋亡的影響,進一步探討其作用機制?

1 材料與方法

1.1 實驗動物?主要試劑及儀器 SD大鼠36只,雄性,體質(zhì)量(250±10)g,清潔級,購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心[合格證號:SCXK(渝)2007-0005],顆粒飼料飼養(yǎng),自由飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗?天麻素購自西安冠宇生物技術(shù)有限公司(純度:99.12%,批號:GY20080822);尼莫地平片購自山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司(20毫克/片,批號:080510);RNA純化試劑盒?Real time RT-PCR試劑盒,以及βactin和caspase-3引物均購自寶生物(大連)工程有限公司;原位末端標記細胞凋亡試劑盒由德國Boehringer Mannheim公司提供?iMark通用酶標儀和Icycler IQ型Real time RT-PCR為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品?

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及給藥 將36只大鼠隨機分為假手術(shù)組?模型組?天麻素低劑量組(15mg/kg)?天麻素中劑量組(30 mg/kg)?天麻素高劑量組(60mg/kg)及尼莫地平組(12mg/kg),每組6只大鼠?各組均于手術(shù)前1周每日上午09:00灌胃給藥,假手術(shù)組給予生理鹽水?采用大腦中動脈閉塞和再灌注的方法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型[2]?

1.2.2 HE染色觀察腦組織病理形態(tài) 大鼠缺血2h,再灌注24h后麻醉斷頭取腦,以視交叉前后兩點冠狀切片,片厚約4 mm,將腦切片放入40g/L甲醛溶液中固定?常規(guī)梯度脫水,透明,包埋,浸蠟,切片(厚6μm),HE染色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察組織學(xué)變化?

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡情況[3]切片常規(guī)脫蠟至水,按試劑盒說明書操作,DAB顯色2～5min,蘇木素復(fù)染,封片?于光鏡下觀察,TUNEL染色陽性并伴有核染色質(zhì)濃聚,核染色質(zhì)靠邊凝集或凋亡小體形成者為凋亡細胞;TUNEL染色陽性但呈彌漫著色為壞死細胞;TUNEL染色陰性為正常細胞?光鏡下隨機選取每張切片梗死周邊組織5個視野(×400)計數(shù)凋亡細胞數(shù)?

1.2.4 Real time RT-PCR檢測 按照說明書提取總RNA并純化,用 Real-time RT-PCR試劑盒檢測腦組織中casepase-3 mRNA的表達?各基因引物序列,β-actin,上游:5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′,下 游:5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′;caspase-3,上 游:5′-AGG TCC AAG TTG CGC GTT TC-3′,下游:5′-CAG AAT GAG GAC TGG GTG AG-3′;總反應(yīng)體積為15μL?反應(yīng)條件為:95℃,10min→(95℃10s,60℃1min)×40個循環(huán)?目的基因的相對表達量以目的基因/內(nèi)參基因表示?

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以±s表示,采用單因素方差分析進行組間檢驗,兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病理改變的影響假手術(shù)組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,細胞密度大;模型組缺血側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)較疏松,間質(zhì)水腫,有散在空腔形成,且出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元變性?壞死,細胞間隙增寬,神經(jīng)元胞核形態(tài)不規(guī)則,細胞核固縮;天麻素低?中?高劑量組及尼莫地平組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)大致正常,病理改變輕微,壞死細胞和凋亡細胞減少,海馬區(qū)可見錐體細胞,見插Ⅱ圖1?

2.2 天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織凋亡細胞的影響模型組大鼠可見大量TUNEL染色陽性的神經(jīng)細胞,天麻素高?中劑量組和尼莫地平組能明顯減少腦缺血再灌注損傷大鼠

TUNEL染色陽性細胞數(shù)(P0.01),見表1?

表1 天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織凋亡細胞的影響(±s,n=6)

表1 天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織凋亡細胞的影響(±s,n=6)

##:P 0.01,與假手術(shù)組比較;**:P 0.01,與模型組比較?

組別 凋亡細胞數(shù)(個)假手術(shù)組9.6±3.8模型組 48.2±9.7##天麻素低劑量組 45.8±5.3天麻素低劑量組 28.4±7.3**天麻素低劑量組 25.0±7.6**尼莫地平組 24.0±4.8**

2.3 天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織caspase-3mRNA表達的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中caspase-3mRNA表達增加(P0.05);與模型組比較,天麻素中?高劑量組和尼莫地平組caspase-3mRNA表達降低(P0.05),見表2?

表2 天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織caspase-3 mRNA表達的影響(±s,n=3)

表2 天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織caspase-3 mRNA表達的影響(±s,n=3)

#:P0.05,與假手術(shù)組比較;*:P0.05,**:P 0.01,與模型組比較?

組別 caspase-3mRNA假手術(shù)組42.4±19.4模型組 166.6±44.7#天麻素低劑量組 118.5±18.0天麻素低劑量組 87.2±6.0*天麻素低劑量組 44.7±4.8**尼莫地平組 39.8±10.7**

3 討 論

腦缺血再灌注損傷后缺氧?水腫和神經(jīng)代謝產(chǎn)物釋放等病理改變引起的繼發(fā)性損傷是影響缺血性腦血管病患者預(yù)后的關(guān)鍵因素?缺血半暗帶內(nèi)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的凋亡是反映繼發(fā)性損傷程度的重要標志,由于這些細胞仍然保留了部分蛋白合成能力并表達某些相關(guān)基因,如能及時給予保護治療,該部位的能量代謝及神經(jīng)組織則可能被挽救?否則就轉(zhuǎn)為不可逆損傷,使梗死灶擴大?因此,治療重點在于挽救缺血半暗帶神經(jīng)組織,即如何保護受損神經(jīng)組織,減少細胞凋亡[4]?

凋亡是細胞自然殺傷過程,是保證細胞正常生長和維持穩(wěn)態(tài)的重要條件,其目的是去除各種異常?受損和癌變的細胞,在腦缺血再灌注損傷后,神經(jīng)元凋亡顯著增加?在腦缺血過程中,缺血半暗帶區(qū)的多種病理生理過程,包括自由基?鈣離子超載?炎性反應(yīng)及線粒體損傷都可以觸發(fā)細胞凋亡[1]?本研究中HE染色及TUNEL結(jié)果均顯示模型組凋亡細胞顯著增多,而天麻素能夠抑制細胞凋亡,凋亡可能決定梗死灶的體積,既往研究中發(fā)現(xiàn)天麻素可顯著減少腦缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死灶面積,提示其減少梗死灶面積可能與其抑制細胞凋亡有關(guān)?

細胞凋亡過程可以大致分為起始期?執(zhí)行期和死亡期3個時期?(1)起始期:細胞通過受體等途徑,接受內(nèi)外環(huán)境發(fā)出的凋亡信號,將其傳遞給執(zhí)行器的過程;(2)執(zhí)行期:caspase-8?caspase-9?caspase-10激活,通過蛋白酶組成的級聯(lián)反應(yīng)激活效 應(yīng) 子——caspase-3?caspase-6?caspase-7,后 者 通 過 激 活DNA酶等導(dǎo)致DNA的斷裂;(3)死亡期:DNA破壞的不斷增加,導(dǎo)致細胞進入不可逆的死亡?從理論上講,凡能阻斷細胞凋亡信號傳遞通路的每一個環(huán)節(jié)均有可能影響細胞凋亡的發(fā)展[5]?caspase參與細胞凋亡的信號傳導(dǎo),其中caspase-3是凋亡過程中最重要的蛋白酶,是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路?腦缺血后,神經(jīng)元caspase-3mRNA表達增加?酶活性增強,本研究中模型組大鼠腦組織中caspase-3mRNA表達明顯增高,而天麻素可降低caspase-3mRNA的表達,抑制神經(jīng)細胞的凋亡?

綜上所述,天麻素可能是通過下調(diào)caspase-3的表達減輕腦組織細胞凋亡,從而縮小腦梗死面積,對缺血再灌注大鼠腦組織發(fā)揮保護作用?

[1] 陳東麗,陳旭東,夏翠英.天麻對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細胞凋亡的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(3):148-150.

[2] 聶晶,杜亮,黃燮南,等.天麻素對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].華西藥學(xué)雜志,2010,25(4):423-425.

[3] 王偉,景桂霞,趙新京,等.瑞芬太尼預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2011,32(1):128-130.

[4] 吳中亮,任寧.天麻素注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報,2008,24(3):204-207.

[5] 賈士奇,王軍,張紅霞,等.生姜對局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(3):163-166.

Inhibitory action of gastrodine on the neuronal apoptosis after focal cerebral ischemia reperfusion*

,,,
(1.,,,563000,;2.,,563000,)

ObjectiveTo investigate the potential mechanisms of gastrodine on the focal cerebral ischemic reperfusion damage in rats.MethodsThe SD rats were administered with gastrodine by gavage once a day for 7days.The animals were then subjected to right-middle cerebral artery occlusion for 2hand reperfusion for 24h.Brain tissues were stained with hematoxylin-eosin.The number of neuronal apoptosis was assessed by terminal oxynucleotidyl transferase mediated dUTP biotin nick end labeling(TUNEL).The mRNA level of caspase-3was detected by Real time RT-PCR.ResultsCompared with the model group,gastrodine significantly attenuated the apoptosis and the expression of caspase-3of rats(P0.05).ConclusionGastrodine can improve the brain injury induced by focal cerebral ischemia-reperfusion in rats.The mechanisms appear to be partly due to the inhibition of apoptosis through the suppression of caspase-3expression.

gastrodia;brain ischemia;reperfusion injury;apoptosis;caspases

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.020

A

1671-8348(2012)18-1841-02

* 基金項目:遵義市紅花崗區(qū)科技局科學(xué)技術(shù)項目[遵紅科合社字(2007)13號]?

2011-07-23

2011-12-25)

?臨床研究?