皮質(zhì)酮對動物骨髓間充質(zhì)干細胞遷移活性的影響及其修復學意義*

高文婷,楊 策,王海燕,嚴 軍,蔣建新

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室/全軍交通醫(yī)學研究所/創(chuàng)傷?燒傷與復合傷國家重點實驗室,重慶 400042)

皮質(zhì)酮對動物骨髓間充質(zhì)干細胞遷移活性的影響及其修復學意義*

高文婷,楊 策,王海燕,嚴 軍,蔣建新△

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室/全軍交通醫(yī)學研究所/創(chuàng)傷?燒傷與復合傷國家重點實驗室,重慶 400042)

目的研究下丘腦-垂體-腎上腺軸效應激素——糖皮質(zhì)激素(GC)對不同動物骨髓間充質(zhì)干細胞遷移活性影響?方法 分離?培養(yǎng)并鑒定大鼠和小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,通過不同方法觀察兩種來源的骨髓間充質(zhì)干細胞趨化活性的變化,評價GC對不同來源的骨髓間充質(zhì)干細胞遷移活性的影響?結果盡管不同種屬來源的骨髓間充質(zhì)干細胞在形態(tài)上存在一定差異,但一定濃度的GC能夠顯著增強其趨化活性(P0.05)?結論急性應激條件下,骨髓間充質(zhì)干細胞遷移活性增強對損傷組織修復具有潛在的臨床意義?

糖皮質(zhì)激素類;間質(zhì)干細胞;骨髓

目前干細胞治療中,移植的干細胞難以有效歸巢并整合到靶組織是嚴重影響其療效的關鍵所在[1-2]?因此,有效改善成體干細胞的遷移能力成為克服諸多基于干細胞治療疾患的難點所在?既往促進干細胞遷移和動員主要應用生長因子?趨化因子?細胞外基質(zhì)分子等,但外源性應用治療常伴有藥物不良反應,因此,如何有效啟動內(nèi)源性修復機制,促進干細胞動員并向損傷組織歸巢成為干細胞治療的關鍵所在?

近十年來,成體干細胞為損傷組織修復帶來新的曙光?研究證實,移植骨髓源性干細胞有望加快創(chuàng)面愈合速度,提高愈合質(zhì)量[3]?截止2012年3月,在國際注冊的干細胞治療皮膚燒傷臨床研究中,分別以移植外源性間充質(zhì)干細胞和募集內(nèi)源性內(nèi)皮祖細胞治療急性創(chuàng)面?事實上創(chuàng)傷應激早期,機體神經(jīng)內(nèi)分泌反應參與調(diào)節(jié)骨髓干細胞在傷后再分布,表現(xiàn)為骨髓干細胞向損傷組織局部募集,其作用過程涉及骨髓干細胞黏附?趨化?分泌等諸多反應過程[4]?鑒于骨髓干細胞具有多向分化潛能,并具有低免疫原性特點,觀察下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)軸效應激素——糖皮質(zhì)激素是否對骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移作用具有重要意義?因此,本研究以不同動物種屬來源的骨髓間充質(zhì)干細胞為對象,采用不同方法觀察不同濃度的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素對其趨化活性的影響,旨在探尋內(nèi)源性促進骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和歸巢能力的新依據(jù)?

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要儀器?試劑 清潔級健康雄性C57/BL6小鼠,4～8周齡,體質(zhì)量22～30g;清潔級健康雄性Sprague-Dauley大鼠,體質(zhì)量80g左右?實驗動物均購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心[許可證號SCXK(軍)2007-017],于恒溫(22±2)℃?12h光照/12h無光照循環(huán)條件下飼養(yǎng),自由飲食?飲水?流式細胞分析儀(BD FACS Calibur)購自BD Parmingen公司(USA);RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基購自 HyClone公司(USA);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Gibco公司;牛血清清蛋白購自Roche公司(USA);48孔Boyden趨化小室趨化板和聚碳酸脂濾膜(5μm 濾孔)均購自 Neuro Probe公司(USA);皮質(zhì)酮(corticosterone)和甲酰三肽(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)均購自Sigma公司(USA);小鼠和大鼠單個核細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司;流式抗體FITC-CD34和FITC-CD45(iso:FITC-IgG2b,κ)購自BD Parmin-gen公司(USA);FcR Blocking Reagent(mouse)購自 Miltenyi Biotec公司(USA);蘇木素液及水溶性伊紅液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司,其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純級?

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 不同種屬動物骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng) 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)參照文獻[5]方法,取4周齡,雄性C57/BL6小鼠,斷頸處死后浸泡于75%(V/V)的乙醇中消毒1 min?將雙下肢皮膚剝離后迅速取出雙側股骨和脛骨,剪開兩側骨端,用2mL注射器吸取干細胞培養(yǎng)基沖取骨髓,吹打混勻后接種于75cm2培養(yǎng)瓶中,加入總量20mL工作培養(yǎng)基,置入5%CO2,37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?48h后首次換液,以后每2～3天換液1次?大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)參照文獻[6]方法,大鼠斷頸處死后,浸入75%(V/V)的乙醇溶液?同法取出雙側股骨和脛骨,浸入含有雙抗的D-Hanks液中,在無菌條件下洗滌并去除肌肉及附著軟組織?吸取10mL工作培養(yǎng)基于10mL小燒杯中?剪開長骨兩端,用注射器帶18G針頭將骨髓沖出,使用5mL滴管吹打骨髓液至肉眼不可見組織塊?將獲得的細胞懸液全部接種于75cm2培養(yǎng)瓶中,同法培養(yǎng)?原代接種24h后,將原培養(yǎng)基吸棄并用20mL D-Hanks液輕輕洗滌后加入等量新鮮工作培養(yǎng)基?接種后第6天細胞約達到90%融合,進行實驗或傳代?

1.2.2 不同種屬動物骨髓間充質(zhì)干細胞的表型鑒定 消化并計數(shù)第3代細胞,方法同上?將每106個細胞分裝在1個1.5mL EP管中,共8管?分別向上述每管細胞懸液中加入PE-CD34及同型對照單克隆抗體?PE-CD90及同型對照單克隆抗體?FITC-CD45及同型對照單克隆抗體?無熒光標記的CD73單克隆抗體及APC-IgG1同型對照單克隆抗體原液1個測試管,并得到細胞懸液體積100μL?4°C避光條件下反應30min?向每管中加入1mL含有3%胎牛血清的PBS,充分混勻后350×g,4℃離心5min,并重復1次?除無熒光標記的CD73單克隆抗體管外,其余管用200μL 3%胎牛血清的PBS重懸,置4℃保存?無熒光標記的CD73單克隆抗體管重懸后加入1個TEST的APC-IgG1單克隆抗體,并調(diào)整細胞懸液體積至100μL?上機檢測前分別從各管取出50μL,其余150μL加入7-AAD做細胞活性檢測?剩余的50μL上機檢測?

1.2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞趨化能力檢測 用0.125%胰蛋白酶消化培養(yǎng)的第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,以培養(yǎng)基終止消化后,計數(shù)細胞;1 000r/min離心5min;用一定體積的預溫結合緩沖液(binding medium,BM),將細胞密度調(diào)整至1×106～2×106個/毫升;采用 Millicell Transwell小室,于24孔板趨化下室加入終濃度為100nmol/L fMLP趨化液600μL;放入懸掛式趨化上室,趨化濾膜孔徑為8μm,加入5×104個MSCs,總體積為400μL;分別含不同濃度糖皮質(zhì)激素(0?75?100?1 500ng/mL)的細胞懸液;將趨化小室置于5%CO2,37°C培養(yǎng)箱孵育4h后,孵育結束后,平穩(wěn)取出上室,棄去液體,以濕棉棒輕輕拭去上方未穿膜細胞;經(jīng)過干燥?固定?染色處理步驟后,顯微鏡觀察計數(shù),趨化結果以趨化指數(shù)(chemotactic index,CI)表示?CI以100倍鏡下4個視野中穿膜骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)目的平均值反映[7]?

1.2.4 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞趨化能力檢測 獲取原代培養(yǎng)7d的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,用BM將細胞密度調(diào)整至1×106個/毫升,采用Neuro Probe趨化小室,向趨化小室下板各孔加入28μL 100.0nmol/L的fMLP,以BM為對照;覆蓋5 μm孔徑的趨化濾膜;趨化小室上板加入50μL含不同濃度糖皮質(zhì)激素(0?75?100?1 500ng/mL)的細胞懸液;將趨化小室置于5%CO2,37°C培養(yǎng)箱孵育,37℃培養(yǎng)箱孵育4h后,孵育結束后,取出濾膜,經(jīng)過刮膜?干燥?固定?染色處理步驟后,同法鏡下觀察并計算CI?

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料以±s表示,兩組間均數(shù)比較用t檢驗?檢驗水準α=0.05,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義?

2 結 果

2.1 不同種屬骨髓間充質(zhì)干細胞鑒定 在所選4個表面標記中,各分子的陽性表達率為:CD34≤0.35%?CD45≤0.40%?CD73≥95.4%?CD90≥99.0%?根據(jù)國際細胞治療協(xié)會(ISCT)的定義[8],對骨髓間充質(zhì)干細胞的表面標記表達率的要求為:陰性標記CD45?CD34的陽性率不高于2%;陽性標記CD73?CD90陽性率不低于95%?因此,本實驗分離培養(yǎng)的兩種骨髓間充質(zhì)干細胞符合該要求?

圖1 糖皮質(zhì)激素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞趨化能力的影響

圖2 糖皮質(zhì)激素對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞趨化能力的影響

2.2 糖皮質(zhì)激素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞趨化能力的影響趨化實驗結果發(fā)現(xiàn),低濃度糖皮質(zhì)激素(75?100ng/mL)可以顯著增加大鼠間充質(zhì)干細胞向fMLP的遷移(P0.01),而高濃度糖皮質(zhì)激素(1 500ng/mL)也對骨髓間充質(zhì)干細胞的趨化功能有明顯促進作用(P0.05),見圖1?

2.3 糖皮質(zhì)激素對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞趨化能力的影響趨化實驗結果發(fā)現(xiàn),低濃度糖皮質(zhì)激素(75?100ng/mL)可以顯著增加小鼠間充質(zhì)干細胞向fMLP的遷移(P0.05),而高濃度糖皮質(zhì)激素(1 500ng/mL)則對骨髓間充質(zhì)干細胞的趨化功能沒有顯著影響(P0.05),見圖2?

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細胞作為一種具有多向分化能力的成體干細胞,可分化為包括軟骨細胞?骨細胞?骨骼肌細胞?脂肪細胞?肝細胞?血管內(nèi)皮細胞?心肌細胞?神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞在內(nèi)的3種胚層細胞,在損傷組織修復中發(fā)揮重要作用[9]?既往研究證實,骨髓間充質(zhì)干細胞能夠在小鼠皮膚創(chuàng)面歸巢,改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量,加速創(chuàng)面愈合過程[10-11];反之,骨髓間充質(zhì)干細胞動員受損時,小鼠創(chuàng)面愈合延遲?恢復動員骨髓間充質(zhì)干細胞后,創(chuàng)面愈合明顯改善[12]?此外,在骨髓間充質(zhì)干細胞參與損傷修復過程中,最近研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細胞除了其強大的組織修復能力外,通過免疫調(diào)節(jié)功能對局部免疫和炎癥反應微環(huán)境有重要調(diào)節(jié)作用,如骨髓間充質(zhì)干細胞可以抑制T?B?NK細胞的增殖和B細胞的遷移[13];抑制Th1細胞分泌促炎細胞因子,促進Th2細胞產(chǎn)生抗炎細胞因子;負向調(diào)節(jié)抗原遞呈細胞樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)的分化和功能[14-15];當骨髓間充質(zhì)干細胞暴露于IFN-γ可以獲得抗原遞呈功能等?此外,骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)作用還有賴于分泌一些可溶性介質(zhì),如PGE2,HGF,TGF-β1和IL-10?一些臨床研究表明,外周血干細胞的數(shù)量與疾病的預后密切相關?因此,基于骨髓間充質(zhì)干細胞重要免疫調(diào)節(jié)功能和免疫豁免特點以及向損傷組織趨化特性,動員足量骨髓間充質(zhì)干細胞到損傷組織,有助于調(diào)節(jié)局部微環(huán)境,促進損傷組織功能修復?

為獲得足量的內(nèi)源性骨髓間充質(zhì)干細胞,既往研究多采用藥物干預方法,主要使用骨髓動員劑等外源性藥物動員骨髓干細胞[16-18]?臨床多采用集落刺激因子,如重組人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)?然而,在hG-CSF動員骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮祖細胞等骨髓來源細胞在創(chuàng)面大量聚集并分泌生長因子的同時,能引起30%的治療患者骨痛?頭痛?四肢乏力,甚至引發(fā)急性肺損傷[19-20]?因此,探尋內(nèi)源性動員機制對于損傷組織修復具有重要價值?

近年發(fā)現(xiàn),神經(jīng)內(nèi)分泌反應對骨髓間充質(zhì)干細胞動員?增殖?分化和修復功能有潛在調(diào)控作用,如交感腎上腺髓質(zhì)和其他內(nèi)分泌器官源性激素(如去甲腎上腺素?雌激素)可以促進不同類型骨髓干細胞從骨髓池外流?鑒于神經(jīng)內(nèi)分泌反應對于骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量的影響以及效應激素在損傷微環(huán)境中的重要作用,調(diào)節(jié)應激反應動員骨髓干細胞的策略可能具有潛在臨床意義?盡管機體遭受應激?損傷時,外周血液循環(huán)中干細胞數(shù)量增多可能難以完全滿足嚴重損傷時創(chuàng)面修復需要,但科學調(diào)理內(nèi)源性應激激素水平,對于增強骨髓間充質(zhì)干細胞動員的促修復效果可能有重要價值?例如,在對嚴重創(chuàng)(燒)傷?休克?外科大手術后常見并發(fā)癥(如膿毒癥)治療中發(fā)現(xiàn),膿毒性休克患者腎上腺皮質(zhì)功能不全發(fā)生率約為50%,而應用小劑量糖皮質(zhì)激素(如氫化可的松,每日劑量不超過300mg,50～100毫克/次,3～4次/天,治療持續(xù)1周),使膿毒性休克逆轉率和患者生存率顯著提高?然而值得注意的是,大劑量糖皮質(zhì)激素治療嚴重膿毒癥并不能提高患者的生存率,且增加了再感染機會?這可能與不同濃度糖皮質(zhì)激素所產(chǎn)生的特定效應有關?

前期的研究證實,血漿糖皮質(zhì)激素水平與應激模型有關[21-22]?慢性 長 時 間 心 理 應 激 后 糖 皮 質(zhì) 激 素 為 46～80 ng/mL?跑步?游泳等疲勞應激后糖皮質(zhì)激素數(shù)分鐘內(nèi)快速升高,其濃度范圍為100～550ng/mL,應激后1h的血漿糖皮質(zhì)激素維持在150～480ng/mL,應激后3h,迅速降低至40ng/mL?而其他生理應激如妊娠,疼痛等狀態(tài)下糖皮質(zhì)激素水平也顯著升高,如小鼠妊娠16d血漿糖皮質(zhì)激素達到峰值,約1 079～1 687ng/mL,電擊小鼠血漿皮質(zhì)酮可達80.6～330.0 ng/mL?作者在前期實驗中發(fā)現(xiàn),強迫跑步應激后1h,小鼠血漿皮質(zhì)酮與對照相比升高了約25倍,約75ng/mL,在此條件下觀察到外周血骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量增多?因此,本研究采用75?100?1 500ng/mL終濃度的糖皮質(zhì)激素模擬急性應激和部分生理應激條件下糖皮質(zhì)激素對骨髓骨髓間充質(zhì)干細胞趨化作用的影響,對于揭示動物體內(nèi)骨髓骨髓間充質(zhì)干細胞動員反應具有重要意義?雖然高?低濃度的糖皮質(zhì)激素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞趨化均有促進作用,然而對于小鼠而言,低濃度的糖皮質(zhì)激素可顯著增加小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向fMLP的遷移,而高濃度糖皮質(zhì)激素(1 500ng/mL)則對骨髓間充質(zhì)干細胞的趨化功能無顯著影響?結合臨床實際,提示低濃度糖皮質(zhì)激素的良好療效可能與骨髓間充質(zhì)干細胞向損傷組織的趨化有關,相關機制尚待深入研究?

目前,在臨床應用中,雖然糖皮質(zhì)激素可引起一系列包括醫(yī)源性庫欣綜合征?骨質(zhì)疏松?類固醇性糖尿病?高脂血癥等不良反應,但此類反應嚴重程度與用藥劑量?時間呈正相關?探索不同劑量糖皮質(zhì)激素的治療效應,加深對糖皮質(zhì)激素作用機制的認識,可以有效避免或減輕這些不良反應,如低鈉?高鉀?高蛋白飲食預防藥物性糖尿病和高脂血癥;補充鈣劑和維生素D防治骨質(zhì)疏松;合并感染時聯(lián)合應用抗生素預防感染擴散及加重等?因此,應用包括糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌激素動員內(nèi)源性骨髓間充質(zhì)干細胞向損傷部位募集可能成為促進損傷組織修復的重要手段之一?

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Effects of corticosterone on migration activity of mesenchymal stem cells and its prosthetics significance*

,,,,
(//,,,,400042,)

ObjectiveTo investigate the effects of glucocorticoid,the effector hormone of hypothalamus-pituitary-adrenal(HPA)axis on the migration activity of bone marrow derived mesenchymal stem cells in different animal species.MethodsThe mesenchymal stem cells in mice and rats were isolated,cultivated and identified.Then their chemotaxis activity was observed and the effects of glucocorticoid in these courses were detected by different methods.ResultsAlthough the mesenchymal stem cells from different animal species exhibited the difference in morphology,their chemotaxis activity was both enhanced after some concentration of glucocorticoid treatment.ConclusionThe improvement of mesenchymal stem cells chemotaxis activity is of great importance for the repair of injured tissues after acute stress.

glucocorticoids;mesenchymal stem cells;bone marrow

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.002

A

1671-8348(2012)18-1788-04

* 基金項目:國家重點基礎研究計劃項目(973計劃,2012CB518102);創(chuàng)傷燒傷復合傷國家重點實驗室課題(2009ZZ008)?△

,Tel:(023)68757401;E-mail:hellojjx@126.com,jiangjx@cta.cq.cn?

2012-03-22

2012-05-14)

?臨床研究?