重組hCDMP1腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對其向軟骨分化的影響

王月田,崔 穎,潘欣宇,姚 梅,張 本,李 諶

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121001)

重組hCDMP1腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對其向軟骨分化的影響

王月田1,崔 穎2△,潘欣宇1,姚 梅1,張 本2,李 諶2

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121001)

目的探討人軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1(CDMP1)基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖及分化的影響?方法

采用腺病毒轉(zhuǎn)染方法將重組人CDMP1(hCDMP1)基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的兔BMSCs,用免疫印跡法(Western blot)檢測hCDMP1蛋白質(zhì)的表達(dá),并通過檢測細(xì)胞增殖能力(MTT法)?Ⅱ型膠原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表達(dá),分析轉(zhuǎn)染hCDMP1對BMsCs增殖?分化的影響?結(jié)果hCDMP1蛋白在基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)得到正確表達(dá);hCDMP1基因轉(zhuǎn)染組和對照組相比,ColⅡ?蛋白多糖表達(dá)水平顯著增高(P0.05),而細(xì)胞增殖能力無明顯變化(P0.05)?結(jié)論外源基因轉(zhuǎn)染可以使BMSCs表達(dá)有生物活性的hCDMP1,高表達(dá)的hCDMP1可以促進(jìn)BMSCs向軟骨表型分化,但對細(xì)胞增殖無明顯影響?

骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類;骨髓;間質(zhì)干細(xì)胞;軟骨發(fā)生;轉(zhuǎn)染

目前選用何種生長調(diào)節(jié)因子以及如何保證其持續(xù)高效的刺激作用在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向軟骨分化的研究中還處于探索階段?研究已證明轉(zhuǎn)化生長因子?骨形態(tài)發(fā)生蛋白?生長分化因子等在誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1]?軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種多肽生長因子,具有特異的軟骨誘導(dǎo)能力,可在異位誘導(dǎo)形成軟骨[2]?近年來有關(guān)CDMP1對BMSCs的誘導(dǎo)作用的研究多數(shù)是重組因子的直接刺激作用,但細(xì)胞因子在體內(nèi)代謝快,持續(xù)時(shí)間短,誘導(dǎo)效率低?通過基因工程技術(shù)將外源CDMP1基因?qū)隑MSCs,使其持續(xù)?穩(wěn)定?高效表達(dá)目的基因是解決上述問題的一種措施?

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清?L-DMEM培養(yǎng)基?青霉素?鏈霉素?胰蛋白酶?臺盼藍(lán)?淋巴細(xì)胞分離液?Ad-CMV-CDMP1-IRES-eGFP?Ad-CMV-eGFP?甲 基 噻 唑 基 四 唑 (methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒?免疫組化試劑盒?Ⅱ型膠原蛋白多克隆抗體及甲苯胺藍(lán);兔抗人CDMP1單克隆抗體由遼寧醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科實(shí)驗(yàn)室提供?清潔級新西蘭白兔購自遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心?

1.2 BMSCs的分離和培養(yǎng) 取1月齡左右的健康新西蘭白兔,無菌條件下分離雙側(cè)股骨,分別剪開股骨兩端,不含血清的L-DMEM沖洗骨髓腔,4號針頭反復(fù)吹打沖出的骨髓液,100目篩網(wǎng)過濾,參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行細(xì)胞的分離和培養(yǎng)?

1.3 腺病毒介導(dǎo)重組人CDMP1轉(zhuǎn)染BMSCs

1.3.1 取第3代兔BMSCs以5×105/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,常規(guī)培養(yǎng)24h,待細(xì)胞貼壁后吸去上清?按照公式感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=(蝕斑形成單位/mL)×所取病毒液體積/待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù),取腺病毒病毒液以MOI 50?100?200?300四個(gè)值轉(zhuǎn)染 MSCs,留下2孔作為陰性對照?37℃孵育3h,換成完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48～72h,熒光倒置顯微鏡下檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP),以不引起明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)的最大MOI作為腺病毒的最佳MOI值?

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 取第3代生長狀態(tài)良好的BMSCs 9瓶,待細(xì)胞生長至約80%匯合,隨機(jī)分為3組?各種病毒液以最佳MOI值分別轉(zhuǎn)染BMSCs,48～72h在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果?實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染 Ad-CMV-hCDMP1-IRES-eGFP;對照組:轉(zhuǎn)染 Ad-CMV-eGFP;陰性組:未轉(zhuǎn)染病毒?

1.4 CDMP1基因轉(zhuǎn)染后BMSCs的增殖和分化

1.4.1 甲苯胺藍(lán)染色及免疫組化方法檢測細(xì)胞蛋白多糖基質(zhì)?Ⅱ型膠原的表達(dá) 取上述3組細(xì)胞爬片(每組10張),丙酮固定,行Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍(lán)染色?醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定染色的吸光度?200倍鏡下切片隨機(jī)選取3個(gè)陽性視野測量吸光度,取其平均值代表該標(biāo)本的蛋白表達(dá)強(qiáng)度?結(jié)果以±s表示?

1.4.2 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活力,繪制細(xì)胞生長曲線取上述3組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL,接種于96孔培養(yǎng)板?第1～9天每天同一時(shí)點(diǎn),每組隨機(jī)選3孔,按照MTT試劑盒說明進(jìn)行操作?

1.4.3 Western blot檢測hCDMP1多肽的表達(dá) 取上述3組適量細(xì)胞,用PBS洗滌3遍,以150μL裂解液裂解細(xì)胞,收集上清液,用RIPA裂解緩沖液(RIPA lysis buffer)稀釋,進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,用兔抗人CDMP1單克隆抗體標(biāo)記?膜經(jīng)徹底洗滌后,用過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG進(jìn)行二抗標(biāo)記?膜上加1mL化學(xué)發(fā)光劑及增強(qiáng)劑的混合液,暗室反應(yīng)1min,X光膠片曝光,顯影,照相?

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析?以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BMSCs剛分離接種時(shí),其內(nèi)有血細(xì)胞混雜,不易分辨成分?可見貼壁細(xì)胞呈三角形?多角形或短梭形,在部分區(qū)域有細(xì)胞的小集落形成,數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)不等?7d后貼壁細(xì)胞體積增大,細(xì)胞形態(tài)基本一致,呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)?10～12d后貼壁細(xì)胞體逐漸增多并連接成片,呈魚群狀排列?傳代培養(yǎng)細(xì)胞比原代細(xì)胞成分純凈,含少量的混雜細(xì)胞?2d后大部分細(xì)胞貼壁,細(xì)胞形態(tài)較舒展,3～4d可見細(xì)胞增殖,呈典型的長梭形,細(xì)胞數(shù)明顯增加,7～8d長滿瓶底?

2.2 感染后BMSCs增殖活力的檢測 MTT比色檢測結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在第3天進(jìn)入對數(shù)生長期,第6天進(jìn)入平臺期,第8?9天生長開始減慢,生長曲線和對照組基本相似?實(shí)驗(yàn)組吸光度(A570)值在各時(shí)點(diǎn)均高于對照組和陰性組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.794)?

2.3 CDMP1基因修飾后的表達(dá) 感染后24h實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞在熒光顯微鏡下均可見到少量綠色熒光,48h明顯增多,72h可見到大量綠色熒光,熒光與細(xì)胞輪廓一致,轉(zhuǎn)染率為90%以上,持續(xù)14d以上(封2圖1)?陰性組細(xì)胞無綠色熒光?Western blot結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)相對分子質(zhì)量約55.6×103的明顯的電泳條帶,而對照組和陰性組則未顯示(封2圖2)?

2.4 基因修飾后細(xì)胞外基質(zhì)的檢測 Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)較明顯的棕色顆粒(封3圖3),而對照組和陰性組顯色較弱?甲苯胺藍(lán)染色顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)呈深藍(lán)紫色,而對照組和陰性組顯色較弱?經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析,實(shí)驗(yàn)組?對照組及陰性組Ⅱ型膠原表達(dá)(以積分光密度IOD表示,下同)IOD 分別為:35.17±1.07?10.32±1.01?10.24±0.90?實(shí)驗(yàn)組與對照組?陰性組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?實(shí)驗(yàn)組?對照組及陰性蛋白多糖表達(dá)IOD分別為:38.34±1.28?11.44±1.09?10.45±1.11?實(shí)驗(yàn)組與對照組?陰性組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?

3 討 論

創(chuàng)傷和疾病引起的頭頸部軟骨缺損的修復(fù)是耳鼻咽喉科?頭頸外科醫(yī)師面臨的難題?軟骨組織工程為解決這一臨床難題帶來了新的思路和方法?種子細(xì)胞作為軟骨組織工程三要素之一[4],應(yīng)具有:來源穩(wěn)定?取材方便?體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng)?細(xì)胞表型穩(wěn)定?耐機(jī)體免疫性高?無致瘤性等優(yōu)點(diǎn)[5]?BMSCs是源于中胚層和外胚層的一類多能干細(xì)胞,因具有自我更新?多向分化?造血支持?促進(jìn)干細(xì)胞植入和免疫調(diào)控的特點(diǎn),成為目前公認(rèn)的理想的種子細(xì)胞[6]?常用的分離BMSCs的方法有全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法?馬林祥等[7]選用全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法二者結(jié)合的優(yōu)化方案,可以得到較純凈的BMSCs?實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化方案,經(jīng)原代培養(yǎng)獲得BMSCs可在體外傳20代以上,在數(shù)量上能夠滿足組織工程種子細(xì)胞的需要?

CDMP1也即生長分化因子5,是轉(zhuǎn)化生子因子-β超家族的成員,也是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的新亞型[8]?CDMP1是一種分泌的信號分子,在人體骨骼的發(fā)育和增長中起關(guān)鍵作用[9],在軟骨形成的初期主要是促進(jìn)間充質(zhì)前軟骨細(xì)胞的黏附?聚集和分化,后期則顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成熟和肥大?CDMP1基因突變或缺失導(dǎo)致軟骨細(xì)胞黏附?增殖能力下降,使機(jī)體在發(fā)育階段不能形成正常軟骨而致肢體畸形?

隨著組織工程和基因工程的發(fā)展,細(xì)胞治療和基因治療對損傷修復(fù)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響[10]?基因療法是一種控制功能蛋白質(zhì)及其過程的時(shí)空表達(dá)有效的方法,可能按照一種生理性釋放調(diào)整[11]?有人用脂質(zhì)體成功將hCDMP1基因轉(zhuǎn)染BMSCs并誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞,但脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率低?目前病毒載體是其最有效的方法,通常采用的病毒載體有腺病毒?逆轉(zhuǎn)錄病毒?腺相關(guān)病毒和單純皰疹病毒本載體,腺病毒載體對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是有用的[12],但安全性尚未確定,基因表達(dá)的可控性有待提高?

本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒攜帶hCDMP1基因成功導(dǎo)入BMSCs,Western blot等方法證實(shí)目的基因得到了穩(wěn)定表達(dá),為以后運(yùn)用該技術(shù)將hCDMP1用于基因治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?hCDMP1基因轉(zhuǎn)染未引起B(yǎng)MSCs的過度增殖或抑制,保持了細(xì)胞原有的生長狀態(tài)?Ⅱ型膠原和細(xì)胞蛋白多糖是軟骨細(xì)胞的特征性標(biāo)志?基因轉(zhuǎn)染后BMSCs合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強(qiáng),實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原和細(xì)胞蛋白多糖基質(zhì)表達(dá)水平與對照組比較,均顯著提高,提示hCDMP1有誘導(dǎo)BMSCs向軟骨表型分化的作用?所以,將hCDMP1基因轉(zhuǎn)染的BMSCs用于體外構(gòu)造工程化軟骨,或?qū)⑵浜蜕锝到獠牧舷嘟Y(jié)合移植體內(nèi)修復(fù)軟骨缺損,促進(jìn)了基因加強(qiáng)軟骨工程的更大發(fā)展?

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Effects of adeno-hCDMP1 transfection on in vitro chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

, ,,,
(1.,121001,;2.,121001,)

ObjectiveTo investigate the effects of gene transfaction with human cartilage-derived morphogenetic protein 1(CDMP1)on the differentiation and proliferation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs).MethodsBMSCs were obtained from New zealand rabbits.Exogenous recombinant hCDMP1was transfected into BMSCs with adenovirus method.Then hCDMP1expression at protein level was measured by western blot method.Expression of Type 1Icollagen(ColⅡ),proteoglycan and growth of the cells were all measured by biologicalMethodsto evaluate the effects of gene transfer on the differentiation of rabbit BMSCs.ResultsAfter hCDMP1gene transfection,BMSCs expressed hCDMP1protein,and compared with the control groups,expression of proteoglycan and ColⅡincreased significantly,but no significant difference appeared in cell proliferation.ConclusionGene transfer with hCDMP1is an effective way to enhance the expression of CDMP1at protein.The expression of heterogenetic hCDMP1gene can induce BMSCs′differentiation to chondrogenic cells.But the gene transfection has no obvious effects on the proliferation of BMSCs.

bone morphogenetic proteins;bone marrow;mesenchymal stem cells;chondrogenesis;transfection

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.004

A

1671-8348(2012)16-1570-02

△通訊作者,E-mail:Yingwu2002@163.com?

2011-10-12

2011-11-30)

?基礎(chǔ)研究?