鉤藤堿對(duì)豬冠狀動(dòng)脈平滑肌舒縮作用的影響及其機(jī)制*

李鵬云,楊 艷,程 俊,劉智飛,裴 杰,周 文,曾曉榮

(瀘州醫(yī)學(xué)院心血管醫(yī)學(xué)研究所,四川瀘州 646000)

鉤藤堿對(duì)豬冠狀動(dòng)脈平滑肌舒縮作用的影響及其機(jī)制*

李鵬云,楊 艷,程 俊,劉智飛,裴 杰,周 文,曾曉榮△

(瀘州醫(yī)學(xué)院心血管醫(yī)學(xué)研究所,四川瀘州 646000)

目的觀察鉤藤堿對(duì)離體豬冠狀動(dòng)脈血管的作用,并探討其作用機(jī)制?方法 采用血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)及全細(xì)胞穿孔膜片鉗技術(shù)分別觀察鉤藤堿對(duì)離體豬冠狀動(dòng)脈血管環(huán)張力的影響以及對(duì)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)的作用?結(jié)果血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)顯示鉤藤堿能夠明顯舒張[(89.94±1.18)%,n=7]高鉀(40mmol/L)去極化所致的冠狀動(dòng)脈血管收縮,而K+通道阻斷劑四乙基胺(TEA)不能抑制鉤藤堿的舒血管作用,提示K+通道幾乎不參與鉤藤堿對(duì)豬冠狀動(dòng)脈血管的舒張?在全細(xì)胞穿孔膜片鉗模式下,鉤藤堿(100μmol/L)可顯著抑制豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的BKCa通道[(48.22±4.24)%,n=6],BKCa通道介導(dǎo)的自發(fā)性瞬時(shí)外向電流(STOCs)的幅度和頻率也分別下降了(45.74±6.26)%和(87.98±6.39)%(n=5)?結(jié)論鉤藤堿可明顯舒張豬冠狀動(dòng)脈血管,而對(duì)全細(xì)胞BKCa通道具有明顯的抑制作用,K+通道的激活在鉤藤堿的舒血管機(jī)制中所起的作用不大?

鉤藤屬;鉀通道,鈣激活;肌,平滑,血管;冠狀動(dòng)脈

鉤藤,性甘寒,具有清熱平肝?熄風(fēng)鎮(zhèn)痙之功效,是著名平肝熄風(fēng)代表方“天麻鉤藤飲”的主藥之一?現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明鉤藤具有擴(kuò)張外周血管?降壓?抑制心肌肥厚?負(fù)性肌力及負(fù)性頻率的作用[1],臨床上主要用于治療高血壓?癲癇等心腦血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病?中藥化學(xué)研究證明鉤藤堿是中藥鉤藤的主要有效活性成分之一[2],其藥理學(xué)活性與鉤藤近似,具有顯著的抗高血壓和神經(jīng)保護(hù)作用[3]?目前采用動(dòng)物模型研究表明,鉤藤堿抗高血壓效應(yīng)主要與其舒血管活性相關(guān),但鉤藤堿對(duì)冠狀動(dòng)脈血管的舒縮作用及其離子通道機(jī)制的研究目前未見報(bào)道?

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channel,BKCa)是血管舒縮活動(dòng)調(diào)節(jié)中的重要靶點(diǎn)?相對(duì)少量BKCa通道的激活就可造成細(xì)胞膜超極化,間接抑制L 型 電 壓 依 賴 性 鈣 通 道 (L-type voltage-dependent calcium channel,L-VDCCs)活動(dòng),從而負(fù)反饋調(diào)節(jié)平滑肌的舒張[4]?近年來(lái)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)上簇集分布的蘭諾定受體(ryanodine receptors,RyRs)的協(xié)調(diào)開放激活BKCa通道產(chǎn)生的自發(fā)性瞬時(shí)外向電流(spontaneous transient outward currents,STOCs)是生理狀態(tài)下BKCa通道發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控的基礎(chǔ)[5]?

有研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)面向外式膜片下,鉤藤堿(60μmol/L)可激活平滑肌細(xì)胞的BKCa通道[6-7]?而鉤藤堿在全細(xì)胞模式下或組織水平能否引起B(yǎng)KCa開放增加,目前未見報(bào)道?本研究以豬冠狀動(dòng)脈為研究對(duì)象,采用血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)及全細(xì)胞穿孔膜片鉗技術(shù),探討鉤藤堿對(duì)血管張力的調(diào)節(jié),以及全細(xì)胞模式下鉤藤堿對(duì)平滑肌細(xì)胞BKCa的影響?

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 鉤藤堿(純度≥98%,中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心提供,批號(hào)1266-070214)?清蛋白?木瓜蛋白酶?H型膠原酶?透明質(zhì)酸酶?二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)?羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid,HEPES)?乙二醇四乙酸酯(ethylene glycol tetraacetate,EGTA)?四乙基胺(tetraethylammonium,TEA)?二性霉素B?蝎毒素(ibetiotoxin,IbTX)均購(gòu)自Sigma公司,余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 主要實(shí)驗(yàn)溶液 臺(tái)式液:NaCl 127mmol/L,KCl 5.9 mmol/L,MgCl21.2mmol/L,CaCl22.4mmol/L,葡萄糖12.0 mmol/L,HEPES 10.0mmol/L,pH 7.4(NaOH)?無(wú)鈣臺(tái)式液除不含CaCl2外,其余成分與臺(tái)式液一致?除特殊注明外,采用以下記錄BKCa通道電流的電極內(nèi)液和浴液?電極內(nèi)液:K-天冬氨酸110mmol/L,KCl 30mmol/L,NaCl 10mmol/L,MgCl21mmol/L,EGTA 0.05mmol/L,HEPES 10mmol/L,二性霉 素 B 200μg/mL,pH 7.2(KOH);浴 液:NaCl 134 mmol/L,CaCl21.8mmol/L,MgCl21mmol/L,KCl 6mmol/L,葡萄糖10mmol/L,HEPES 10mmol/L,pH 7.4(NaOH)?酶液l為含0.86g/L木瓜蛋白酶?2.0g/L清蛋白?1.5g/L DTT的無(wú)鈣臺(tái)氏液;酶液2為含1.24g/L H型膠原酶?1.5g/L透明質(zhì)酸酶及1.5g/L清蛋白的無(wú)鈣臺(tái)氏液?

1.3 離體豬冠狀動(dòng)脈血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn) 屠宰場(chǎng)處死豬后,迅速取出心臟并用生理鹽水沖洗淤血,冷凍保存后立即送往實(shí)驗(yàn)室?分離出左冠狀動(dòng)脈前降支(內(nèi)徑約1～2mm,壁厚約0.5mm),放入盛有臺(tái)氏液的器皿中,仔細(xì)剔除血管壁上的脂肪?纖維組織和外膜,注意盡量減少對(duì)組織的損傷?將分離出的冠狀動(dòng)脈血管剪成長(zhǎng)約0.5cm的血管環(huán),浸入臺(tái)式液中4℃冰箱保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)時(shí),將血管環(huán)固定在通95%O2和5%CO2,37℃的恒溫浴槽中,通過(guò)張力換能器與多道生理記錄儀輸入端相連,將血管環(huán)張力傳遞至Powerlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)?冠狀動(dòng)脈血管前負(fù)荷1g,平衡60min并間隔20min更換臺(tái)式液,待基線平穩(wěn)后開始實(shí)驗(yàn)?標(biāo)本穩(wěn)定后,加入高濃度的KCl溶液,使肌槽內(nèi)終濃度為40mmol/L,引起冠狀動(dòng)脈環(huán)發(fā)生最大收縮,穩(wěn)定10～15min?在此基礎(chǔ)上觀察鉤藤堿對(duì)血管張力的影響?實(shí)驗(yàn)開始前所有動(dòng)脈環(huán)用40mmol/L KCl多次刺激,當(dāng)標(biāo)本對(duì)刺激穩(wěn)定時(shí),即相鄰連續(xù)兩次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別小于10%時(shí),且在此基礎(chǔ)上10μmol/L乙酰膽堿所引起的舒張幅度小于20%,可認(rèn)為內(nèi)皮去除?之后用新鮮的臺(tái)式液換洗后開始正式實(shí)驗(yàn),觀察藥物干預(yù)的作用?

1.4 參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法?將外膜和纖維?脂肪組織剔除干凈的血管置于預(yù)冷臺(tái)式液中,縱向剖開血管后用細(xì)小的棉簽在其內(nèi)膜面輕輕來(lái)回摩擦幾下以去除內(nèi)皮,之后將其斜行剪成2mm×5mm的條塊?將組織塊放入酶液1,在37℃恒溫水浴箱內(nèi)振蕩消化15～20min左右,將組織取出轉(zhuǎn)入酶液2中繼續(xù)消化8～10min,之后取出組織置于無(wú)鈣臺(tái)式液中用吸管輕輕吹打,吸取細(xì)胞懸液于倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察,如能找到4～5個(gè)細(xì)胞/低倍視野,且細(xì)胞膜完整光滑,折光性好,即可中止消化?細(xì)胞懸液于4℃保存?zhèn)溆?

1.5 BKCa通道電流的記錄 實(shí)驗(yàn)在室溫下(20～25℃)進(jìn)行,將分離所得的冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡臺(tái)的浴槽中,將灌有電極液的微管電極固定于電極夾持器上,給予電極內(nèi)一定正壓,用微電極操縱器控制微管電極浸入浴液,發(fā)放振幅l mV?波寬40ms的矩形脈沖作為參考脈沖,檢測(cè)電極尖端阻抗并觀察封接形成過(guò)程,調(diào)節(jié)放大器“V-COMP”旋鈕補(bǔ)償液接電位為零?操縱微推進(jìn)器使電極尖端貼附在細(xì)胞表面,在示波器上可見應(yīng)答電流(參考脈沖振幅)減少,稍加負(fù)壓(10～20cmH2O)即可見應(yīng)答電流下降直至為零,電流噪聲隨之減小,表明高阻封接形成(阻抗高達(dá)10GΩ以上),即形成細(xì)胞貼附式膜片(cel1-attached patch)?調(diào)節(jié)C-fast進(jìn)行快電容補(bǔ)償?在此基礎(chǔ)上,二性霉素B在細(xì)胞膜片上逐漸穿孔形成全細(xì)胞構(gòu)型,補(bǔ)償串聯(lián)電阻使其最小化(一般小于10MΩ),同時(shí)調(diào)節(jié)C-slow進(jìn)行慢電容補(bǔ)償,之后即可對(duì)細(xì)胞實(shí)行電壓鉗制?用一小的超極化電壓方波脈沖測(cè)定全細(xì)胞膜電容引起的電流瞬變:保持電位(holding potential,HP)-60mV,階躍超極化到-65mV,方波持續(xù)時(shí)間20ms,以此計(jì)算細(xì)胞膜電容(membrane capacitance,Cm)?全細(xì)胞BKCa通道電流采用階躍方波除極或斜坡除極脈沖引出?階躍方波脈沖方案:HP:-60mV,從-50mV以10mV階躍除極至+70mV,脈沖時(shí)程400ms?斜坡脈沖方案:HP:-60mV,斜坡從-80mV以0.028V/s的速度除極至+70mV?電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器(CEZ-2300)放大,1kHz低通濾波,經(jīng)12位 A/D?D/A轉(zhuǎn)換器(Digidata 1322A,Axon Instrument,USA),在 專 用 軟 件PCLAMP(Version 10.1,Axon Instrument,USA)支持下記錄儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)?采樣頻率為10kHz,采樣方式為Clampex下的Episodic stimulation?

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 鉤藤堿對(duì)豬冠狀動(dòng)脈血管張力的影響 平衡約1h血管張力穩(wěn)定后,在恒溫浴槽中加入40mmol/L KCl,見圖1A,血管張力即刻顯著增加,張力基本穩(wěn)定后在臺(tái)式液中直接加入100μmol/L鉤藤堿,觀察到KCl誘發(fā)的血管張力增加幾乎完全被抑制,20min后血管張力約下降了89.94%±1.18%(P=0.003,n=7),隨后浴槽中加入 K+通道阻斷劑10mmol/L TEA并不能抑制鉤藤堿引起的血管舒張(P=0.148,n=4);平行實(shí)驗(yàn)中采用10mmol/L TEA阻斷K+通道后,鉤藤堿仍能顯著降低血管張力75.95%±13.41%(P=0.026,n=5),提示K+通道在鉤藤堿的舒張血管機(jī)制中所起的作用不大,見圖1B?

圖1 鉤藤堿對(duì)血管環(huán)張力的影響

2.2 BKCa通道的基本特性 本實(shí)驗(yàn)采用二性霉素B穿孔的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道?給予小的超極化脈沖引出瞬變電流,計(jì)算出細(xì)胞膜電容為(20.74±5.58)pF(n=20)?用階躍方波及斜坡除極脈沖引出的外向電流見圖2A和2B?電流隨著膜電位的增加而增加,具有一定的外向整流特性,在較高除極電壓時(shí)電流呈現(xiàn)大噪聲樣特征?在觀察的2h內(nèi),記錄的電流未發(fā)現(xiàn)“rundown”現(xiàn)象?同時(shí)實(shí)驗(yàn)中觀察到STOCs隨機(jī)性地疊加到全細(xì)胞BKCa電流上?BKCa通道特異性阻斷劑蝎毒素(iberiotoxin,IbTX)200nmol/L幾乎完全抑制BKCa宏觀電流及其上疊加的STOCs(n=5)(圖2B和2D)?單個(gè)STOC呈不對(duì)稱的鐘型,快速上升[上升時(shí)間=(15.02±0.89)ms],緩慢衰減[衰減時(shí)間=(31.72±1.86)ms]?圖2C顯示了在不同鉗制電壓下的全細(xì)胞STOCs圖形:當(dāng)細(xì)胞膜的鉗制電壓在-60mV時(shí),STOCs僅有少數(shù)出現(xiàn);隨著細(xì)胞膜去極化程度的增大(-50～―10mV),可觀察到STOCs的幅度和頻率均明顯增加?

2.3 鉤藤堿對(duì)BKCa宏觀電流及STOCs的影響 實(shí)驗(yàn)中觀察BKCa宏觀電流基本穩(wěn)定后,細(xì)胞外給予鉤藤堿,使其終濃度為100μmol/L?約10min后可觀察到全細(xì)胞BKCa宏觀電流明顯減小,見圖3A?在+60mV,BKCa宏觀電流較加藥前明顯抑制了(48.22±4.24)%(P=0.024,n=6),加藥前?后記錄到的BKCa宏觀電流密度分別為(15.36±4.31)pA/pF和(7.52±1.98)pA/pF?加藥前后電流變化的電流-電壓關(guān)系曲線(I-V curves)見圖3C?同時(shí),實(shí)驗(yàn)中也觀察到鉤藤堿(100μmol/L)明顯抑制豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STOCs的活性,使其幅度(Amplitude)和頻率(Frequency)分別下降了(45.74±6.26)%(P=0.018,n=5)和(87.98±6.39)%(P=0.032,n=5)?

圖2 豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa宏觀電流及STOCs

圖3 鉤藤堿明顯抑制豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa宏觀電流及STOCs

3 討 論

血管平滑肌的舒縮活動(dòng)受諸多因素的影響,包括神經(jīng)調(diào)節(jié)?體液調(diào)節(jié)和肌源性調(diào)節(jié)?在上述調(diào)節(jié)機(jī)制中,離子通道起著非常重要的作用?電壓依賴性鈣通道和鉀通道在調(diào)控血管舒縮活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用?Ca2+通道的抑制和K+通道的激活均可導(dǎo)致血管舒張[9]?其中,BKCa是血管平滑肌細(xì)胞上廣泛存在的一類K+通道,攜帶約70%～80%的外向電流,在調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈血流量中起著舉足輕重的作用?

血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)表明,K+通道阻斷劑TEA不能抑制鉤藤堿的血管舒張效應(yīng),提示K+通道在鉤藤堿對(duì)豬冠狀動(dòng)脈血管的舒張機(jī)制中參與的成分很少?目前已經(jīng)明確,KCl引起血管收縮主要與細(xì)胞膜的去極化引起L-VDCCs開放,進(jìn)而使[Ca2+]i增加觸發(fā)興奮收縮耦聯(lián)有關(guān)?因此,本組推測(cè)鉤藤堿對(duì)血管的舒張作用可能與血管平滑肌的L-VDCCs相關(guān)[3]?如已有報(bào)道在離體家兔主動(dòng)脈條,鉤藤堿明顯減少KCl(40mmol/L)溶液所致的Ca2+內(nèi)流量,提示鉤藤堿可能為一種鈣拮抗劑[10]?Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)鉤藤堿可直接抑制大鼠心室肌細(xì)胞的鈣通道?Zhang等[12]在血管環(huán)方面的研究也提示鉤藤堿對(duì)血管的舒張作用可能與L-VDCCs相關(guān);另外,高濃度的鉤藤堿(>100μmol/L)可抑制咖啡因和環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)誘導(dǎo)的血管收縮?以上研究結(jié)果提示鉤藤堿的血管舒張效應(yīng)主要與影響鈣轉(zhuǎn)運(yùn)功能(包括外鈣內(nèi)流和胞內(nèi)鈣釋放)有關(guān)?

實(shí)驗(yàn)中采用全細(xì)胞穿孔膜片鉗技術(shù),首先,觀察了豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa及STOCs的基本特性?與以往研究結(jié)果類似[8],豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的BKCa及STOCs具有明顯的電壓依賴性,兩者均可被BKCa特異性阻斷劑IbTX阻斷,從而證實(shí)STOCs是由BKCa激活產(chǎn)生的?其次,研究了鉤藤堿對(duì)豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa及STOCs的作用?實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鉤藤堿(100μmol/L)可明顯抑制全細(xì)胞BKCa及STOCs,洗脫后電流不能完全恢復(fù)?而開麗和王中峰[6]研究發(fā)現(xiàn),在內(nèi)面向外式膜片下,鉤藤堿可濃度依賴性地激活大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的BKCa,主要通過(guò)增加BKCa的開放概率,降低通道開放時(shí)間?劉書宏等[7]也報(bào)道鉤藤堿可激活人腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa單通道活性?研究結(jié)果的差異可能與以下幾個(gè)因素有關(guān):(1)采用的記錄方式不同?內(nèi)面向外模式主要用于研究通道的動(dòng)力學(xué)特性?在此模式下記錄BKCa單通道電流時(shí),電壓鉗制的僅是一小片細(xì)胞膜,細(xì)胞內(nèi)環(huán)境已發(fā)生了很大的改變,缺少了細(xì)胞內(nèi)一些信號(hào)分子及信號(hào)通路的調(diào)控?而全細(xì)胞模式下,電壓鉗制的是整個(gè)細(xì)胞膜,相對(duì)接近于細(xì)胞的生理狀態(tài),在此模式下記錄到的BKCa電流屬于宏觀電流(macroscopical current),在一定條件下是整個(gè)細(xì)胞上BKCa通道活動(dòng)形成的總和電流?(2)不同記錄模式下細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度不同,BKCa通道對(duì)Ca2+的敏感性可能也存在差異?(3)BKCa活性受到細(xì)胞內(nèi)很多內(nèi)源性信號(hào)分子的調(diào)控[13]?因而在全細(xì)胞模式下,鉤藤堿對(duì)BKCa活性的調(diào)節(jié)過(guò)程中是否涉及一些內(nèi)源性的信號(hào)分子,還需要進(jìn)一步的證實(shí)?

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膜片鉗技術(shù)證實(shí),鉤藤堿可明顯抑制BKCa宏觀電流?結(jié)合血管環(huán)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鉤藤堿在整體動(dòng)物或組織器官水平上表現(xiàn)的舒張血管?降壓的作用可能主要與Ca2+通道抑制有關(guān),進(jìn)而引起細(xì)胞[Ca2+]i下降,BKCa的激活減少?然而,目前關(guān)于鉤藤堿的研究還僅僅局限于單體或有效成分,但中藥應(yīng)用以復(fù)方為主,多味中藥往往協(xié)同作用,且中藥復(fù)方在體內(nèi)代謝復(fù)雜,有效成分也是復(fù)雜多樣,因此,純粹單體的研究并不能很好地說(shuō)明中藥復(fù)方的藥理作用機(jī)制,應(yīng)用膜片鉗技術(shù)研究確切有效的中藥復(fù)方,從細(xì)胞?分子水平闡述其作用機(jī)制,為中藥復(fù)方研究開辟一條新思路,將極大地拓展中藥開發(fā)的前景?

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Mechanism of Rhynchophylline-induced relaxation in porcine coronary artery*

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ObjectiveTo examine the effect of rhynchophylline(Rhy)on porcine coronary artery rings and to investigate the mechanism involved.MethodsThe isometric tension of coronary arterial rings taken from porcine hearts was measured and its response to Rhy(100μmol/L)was studied.The effect of Rhy on BKCacurrents was observed by whole-cell perforated patch clamp configuration.ResultsRhy(100μmol/L)significantly antagonized[(89.94±1.18)%,n=7]the coronary artery tension increase precontracted with KCl(40mmol/L),K+channels blocker TEA(10mmol/L)failed to prevent the relaxation effect of Rhy.Under the perforated whole-cell patch-clamp configuration,Rhy(100μmol/L)significantly inhibited BKCacurrents[48.22%±4.24%,n=6].The mean amplitude and frequency of spontaneous transient outward currents(STOCs)or transient BKCacurrents were also remarkably inhibited by(45.74±6.26)%and (87.98±6.39)%(n=5),respectively.ConclusionRhy relaxes recontracted porcine coronary artery;K+channel activation is almost not involved in coronary artery relaxation induced by Rhy.

uncaria;potassium channels,calcium-activated;muscle,smooth,vascular;coronary

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.001

A

1671-8348(2012)16-1561-03

* 基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30370527)?△

,Tel:0830-3160619;E-mail:zxr8818@vip.sina.com?

2011-10-07

2011-12-12)

?綜 述?