超聲波治療兔膝骨關節(jié)炎對MMP-1和MMP-13表達的影響

李衛(wèi)平,蹇 睿,胥方元

(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院康復科,四川瀘州 646000)

超聲波治療兔膝骨關節(jié)炎對MMP-1和MMP-13表達的影響

李衛(wèi)平,蹇 睿,胥方元△

(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院康復科,四川瀘州 646000)

目的探討兔膝骨關節(jié)炎模型軟骨基質金屬蛋白酶(MMP)-1?-13超聲波治療前后在軟骨組織中的表達及其作用機制?方法 30只新西蘭大白兔隨機分為正常對照組(A組)?模型組(B組)和超聲波治療組(C組),每組10只?B?C組骨關節(jié)炎造模后6周,C組實施超聲波治療,8周后取各組軟骨予HE染色,免疫組化行MMP-1和 MMP-13分析,觀察軟骨HE改變?MMP-1和MMP-13表達的變化?結果HE染色結果采用Mankin′s評分比較,A組與B組?B組與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)?軟骨免疫組化 MMP-1?-13測定,A組與B組?B組與C組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)?結論超聲波能有效治療膝OA,其作用機制可能是減少軟骨MMP-1?-13的含量,降低Ⅱ型膠原的降解?促進新的Ⅱ型膠原的生成,從而有利于軟骨細胞外基質的合成,有利于軟骨細胞的修復?

骨關節(jié)炎;軟骨細胞;超聲療法;基質金屬蛋白酶類

骨關節(jié)炎是一種常見的以關節(jié)軟骨慢性進行性變性和破壞為特征的關節(jié)疾患,其發(fā)病與外傷?炎癥?代謝及免疫等因素有關,目前確切機制未明?近年研究發(fā)現(xiàn)骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨細胞外基質(extracellular matrix,ECM)合成與降解失衡是造成軟骨變性的重要原因之一,基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)可能起決定性作用[1]?本組選擇其家族中的屬于膠原酶亞型的MMP-1?-13采用免疫組化方法觀察它們在骨關節(jié)炎 軟骨中的表達,以研究它們與關節(jié)軟骨退變的關系以及超聲波治療對其表達的影響?

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康新西蘭大白兔30只,雌雄隨機,體質量2.0～2.5kg,5月齡,由瀘州醫(yī)學院動物實驗中心提供?動物合格證:SCXK[川]2008-17?隨機分為正常對照組(A組)?模型組(B組)和超聲波治療組(C組),每組10只?A組不作處理,B?C組行膝骨關節(jié)炎造模?

1.2 儀器與試劑 10%中性甲醛?5%硝酸脫鈣液?多聚賴氨酸?伊紅?蘇木素?PAS緩沖液?MMP-1?MMP-13免疫組化試劑盒(北京博奧申生物工程有限公司);HS-501型超聲波治療儀(韓國)?

1.3 造模方法 取B?C兩組動物采用膝關節(jié)伸直位管型石膏固定法造模?將兔左后肢伸直位固定于實驗固定臺上,在左后肢腹股溝以下1.5cm至踝關節(jié)以上3.0cm用管型石膏繃帶包扎固定,制動6周制作膝骨關節(jié)炎模型?造模6周后取兔2只,進行大體形態(tài)觀察和HE染色病理學觀察,大體形態(tài)觀察顯示關節(jié)液量增多,有明顯的炎癥細胞浸潤,軟骨表面有不同程度的糜爛缺損,HE染色標本顯示軟骨細胞排列紊亂,細胞減少,這些表現(xiàn)與骨關節(jié)炎的病理形態(tài)學變化相一致,確立造模成功?成功后解除石膏外固定[2]?B組不治療,C組采用頻率為3MHz?脈沖式超聲波直接接觸移動法作用于左膝關節(jié)進行治療,劑量0.25W/cm2,每次治療10min,1次/d,連續(xù)治療14d?

1.4 標本取材及檢測 A?B?C組均以空氣栓塞法處死,取股骨內側切口打開膝關節(jié),切取股骨內側髁0.5cm×0.5cm×0.5cm關節(jié)軟骨標本,經(jīng)5%硝酸脫鈣液脫鈣,至大頭針能輕松穿透標本后,石蠟包埋標本,垂直軟骨表面切片,切片厚5μm?

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 光鏡HE染色 切片置于二甲苯及各級乙醇脫蠟至水,再分別置于蘇木素染液?伊紅染液,鹽酸乙醇分化,沖洗,調色脫水,透明,樹膠封片?光鏡觀察軟骨表面是否規(guī)則?有無裂隙,細胞數(shù)量?分布?排列是否規(guī)則,潮線是否完整?參考Mankin′s[3]評分標準對HE染色標本進行評分比較?

1.5.2 免疫組化分析 切片脫蠟至水,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)浸泡修復抗原活性,3%H2O2滅活內源性過氧化物酶,正常血清封閉孵育,依次滴加抗 MMP-1?抗MMP-13生物素標記的二抗,辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復染,脫水,封片,顯微鏡下觀察檢測 MMP-1?MMP-13含量?參照 Pelletier等[4]的方法在MMP-1和 MMP-13的軟骨切片中各隨機選取6個視野(400倍),計算每個視野里的陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù),顯微鏡下胞漿或胞膜有褐色顆粒者為陽性細胞?用細胞分數(shù)即陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比來表示MMP-1?-13的表達量?每張切片的細胞計數(shù)分別由兩個獨立的觀察者進行,其評分誤差率控制在5%以內,取二者均值為最后得分?

1.6 統(tǒng)計學處理 用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析?計量資料用±s表示,對 Mankin′s評分結果和免疫組化 MMP-1?MMP-13的統(tǒng)計結果采用單因素方差分析和t檢驗?P0.05為差異有統(tǒng)計學意義?

2 結 果

2.1 HE染色結果 見封2圖1?A組軟骨層較厚,軟骨著色均勻,軟骨細胞排列整齊,細胞飽滿,潮線清晰?B組軟骨明顯變薄,可見裂隙,部分深達軟骨下骨,基質染色明顯變淺,細胞簇集,有較薄的鈣化層,局部有破壞,軟骨細胞局部排列紊亂,多個軟骨細胞聚集在一起,細胞核濃縮,潮線紊亂?C組染色顯示軟骨層較模型組增厚,表面光滑,偶見小的裂隙形成,著色尚均勻,軟骨細胞排列整齊,細胞飽滿,偶見多個軟骨細胞聚集在一起,細胞核濃縮,潮線紊亂?Mankin′s評分比較見表1?

2.2 免疫組化染色結果 見封2圖2?A組軟骨細胞MMP-1?-13均呈弱陽性表達,僅在表層軟骨細胞內偶見少許胞質棕褐色顆粒?B組MMP-1呈強陽性表達,軟骨基質?胞漿中均有,全層可見,尤以表?中層密度最高,成熟軟骨細胞中較多,為深棕褐色顆粒,MMP-13呈強陽性表達,主要表達于軟骨細胞胞漿內,全層可見,尤以固縮變性的軟骨細胞為重?C組軟骨組織中MMP-1?-13均較B組表達降低,主要是軟骨組織的表?中層減少,為淺棕褐色顆粒?其比較結果見表2?

表1 各組軟骨Mankin′s評分比較

表2 各組軟骨 MMP-1?MMP-13表達的比較

3 討 論

關節(jié)軟骨是一種無血管?神經(jīng)及淋巴分布的結締組織,由99%的軟骨基質和1%的軟骨細胞組成?其正常結構和功能的維持有賴于軟骨細胞和基質成分在形態(tài)與代謝方面的正常與穩(wěn)定[5]?當軟骨細胞及基質特別是含量豐富的Ⅱ型膠原破壞時,即發(fā)生退行性變?柴本甫和湯雪明[6]研究發(fā)現(xiàn),關節(jié)軟骨退變后,軟骨細胞數(shù)目減少,排列紊亂,有不同程度的核凝?核碎裂及核溶等退化壞死現(xiàn)象,軟骨基質染色性改變?本實驗HE染色顯示,伴隨骨關節(jié)炎發(fā)生軟骨層變薄,基質染色變淡,細胞簇集,排列紊亂,呈明顯破壞征象,而在超聲波治療后又出現(xiàn)改善,軟骨層較之有增厚,雖然細胞仍有簇集,但軟骨細胞排列較之整齊,從而說明超聲波治療對膝骨關節(jié)炎的有效性?

MMP是ECM降解最重要的蛋白水解系統(tǒng),被認為是機體生理重建和病理破壞的主要基礎因素之一?在骨關節(jié)炎發(fā)病過程中,MMP因能降解幾乎所有的軟骨ECM而被認為起重要作用[7]?MMP-1?MMP-13均屬 MMPs中的膠原酶亞型,可以直接降解軟骨基質中最具有特征?含量也最多的Ⅱ型膠原,而許多其他MMP亞型對Ⅱ型膠原的降解需要通過它們起作用,因此,理論上 MMP-1?MMP-13等膠原酶的變化最能反映出軟骨基質中Ⅱ型膠原的代謝變化[8]?對于 MMP-1,有的學者將其作為骨關節(jié)炎新的標志性指標,其作用對象主要是新生成的Ⅱ型膠原?研究發(fā)現(xiàn),只有控制了 MMP-1的活性后,培養(yǎng)基中新生成的Ⅱ型膠原才明顯增加[9]?本實驗中也觀察到MMP-1在B組軟骨出現(xiàn)破壞時,其表達明顯升高,而在C組超聲波治療后,軟骨層明顯改善,MMP-1表達也隨之降低,從而考慮超聲波可能通過控制MMP-1的活性而促進軟骨基質及細胞的修復?

MMP-13又稱為膠原酶-3,是所知的酶中最有效的Ⅱ型膠原纖維降解酶[10]?其降解能力是 MMP-1的5～10倍[11-12]?MMP-13在骨關節(jié)炎病變部位的軟骨里,其增高程度和軟骨組織的破壞程度一致,即破壞程度越嚴重,酶的表達越高[13-14]?它和MMP-1一起,打破了基質合成?分解的動態(tài)平衡,增強了關節(jié)軟骨中的降解,尤其是Ⅱ型膠原纖維的降解,使軟骨的完整性破壞,在骨關節(jié)炎發(fā)展過程中,MMP-13發(fā)揮的作用比MMP-1更強?本實驗顯示 MMP-13增高和軟骨組織的破壞呈一致性,超聲治療后病變部位軟骨組織 MMP-13表達出現(xiàn)下降?

超聲波具有機械效應?溫熱效應?理化效應[15]?超聲波治療即利用其良好的組織穿透性,將能量透過表皮組織,聚焦于特定深度的靶區(qū)組織細胞,發(fā)生生化反應,使病變組織產(chǎn)生變性,促進細胞增殖?蛋白質合成,刺激膠原和細胞因子生成[16]?其通過破壞膠原的交聯(lián),使膠原酶解聚和聚合發(fā)生變構,將膠原酶的活化中心激活,活性上升,膠原蛋白分解加速[17]?胥方元等[18-19]臨床實驗證明超聲波對膝骨關節(jié)炎有良好療效,可以促進軟骨?韌帶和肌腱等組織損傷的修復?本實驗選用頻率為3MHz的超聲波治療,深度達1～2cm,利用脈沖式超聲波的非熱效應,使用0.25W/cm2的低強度超聲波治療,將其熱效應最低化,避免熱效應對挫傷肌腱?韌帶及骨軟骨的損害?實驗中,MMP-1和MMP-13在A組大白兔中僅表層軟骨細胞內呈弱陽性表達,B組全層呈強陽性表達,為深棕褐色顆粒,C組軟骨組織中MMP-1?-13均較B組表達降低,且主要是軟骨組織的表?中層表達量減少,作者認為超聲波能抑制兔膝骨關節(jié)炎軟骨組織中MMP-1?-13的表達,可能具有促進軟骨再生?減輕軟骨破壞?減輕軟骨基質損害的作用?其對骨關節(jié)炎的治療機制可能是通過減少軟骨 MMP-1?-13的含量,有效降低軟骨 MMP-1?-13的表達,實現(xiàn)對 MMP/TIMP-1整體抑制作用,減輕MMP的破壞作用,降低Ⅱ型膠原的降解,促進新的Ⅱ型膠原的生成,從而有利于軟骨ECM的合成,有利于軟骨細胞的修復,達到治療骨關節(jié)炎的目的?

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Effect of ultrasonic therapy for treating rabbit knee osteoarthritis on expression of MMP-1 and MMP-13

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ObjectiveTo research the expression of MMP-1and MMP-13of rabbit knee cartilage cells before and after ultrasound therapy and its mechanism.MethodsThe normal control group(group A)contained 10randomly selected rabbits from 30 healthy New Zealand white rabbits,not modeled,the rest 20rabbits were randomly picked and equally divided into the model group(group B)and the ultrasonic experimental group(group C),being created osteoarthritis(OA).After 8weeks,cartilage changes on pathological morphology and immunohistochemical of MMP-1and MMP-13from all groups were observed.ResultsIn the group A,cartilage surface layer had uniform thickness,cartilage cells were aligned with uniform size,which had a little amount of MMP-1and MMP-13.The thickness of cartilage in the group B was thinner with significantly less cartilage cells.The clustering MMP-1and MMP-13rates were higher.Cartilage layer of the group C was thicker than that of the group A,cartilage cells were arranged neatly,MMP-1and MMP-13rates were dropped.By mankin′s score,the degree of pathological lesion in the group B was higher than that of the group A and the group C(P0.01).The expressions of MMP-1,MMP-13were higher than those of the group A and the group C too(P0.01).The differences were significant.ConclusionThe ultrasonic treatment can effectively improve the rabbit knee OA.The mechanisms are probably reducing cartilage MMP-1and MMP-13levels,reducing collagenⅡdegradation,promoting new collagenⅡformation and promoting the proteoglycan,which will help to repair cartilage cells.

osteoarthritis;chondrocytes;ultrasonic therapy;matrix Metalloproteinases

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.002

A

1671-8348(2012)16-1564-03

△通訊作者,Tel:13568639470;E-mail:x5144@163.com?

2011-10-08

2011-12-22)

?調查報告?