醫(yī)療器械免疫原性評價與試驗策略

【作 者】劉成虎，吳平，施燕平，王敏

1 國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心

2 山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室

3 山東恒信檢測技術(shù)開發(fā)中心

近年來，隨著醫(yī)療器械生物學評價方法學研究的不斷深入，醫(yī)療器械免疫毒理學的研究已逐漸成為醫(yī)療器械生物學評價的熱點領(lǐng)域之一。眾所周知，醫(yī)療器械中含有的免疫原是導致其免疫毒性的原因。因此，如何對醫(yī)療器械中含有的免疫原進行評價是控制相關(guān)產(chǎn)品免疫毒性的關(guān)鍵所在。有鑒于此，ISO/TC194 于2006年就推出了ISO/TS 10993-20《醫(yī)療器械免疫毒理學試驗原則和方法》[1]，然而，由于應(yīng)用于醫(yī)療器械的免疫毒理學方面的標準化試驗尚未不成熟。因此，在該ISO技術(shù)規(guī)范中沒有給出具體的試驗方法。本文通過對醫(yī)療器械的免疫毒理學知識的介紹，以期能幫助大家對醫(yī)療器械免疫學評價的理解，更好地使用ISO/TS 10993-20，從而為建立一套完整的醫(yī)療器械免疫原性風險評價體系，有效降低醫(yī)療器械臨床使用時的免疫毒理學風險奠定基礎(chǔ)。

1 醫(yī)療器械中免疫原引起的免疫毒性效應(yīng)

醫(yī)療器械中含有的免疫原是其引發(fā)免疫毒性反應(yīng)的根本原因。免疫原是可能會刺激機體發(fā)生免疫應(yīng)答的異源性物質(zhì)。在考慮醫(yī)療器械中免疫原潛在的免疫毒性危害時，應(yīng)充分考慮器械與人體的接觸方式、接觸時間對免疫毒性效應(yīng)的影響。GB/T16886.1/ISO 10993-1中所列出的每一種接觸方式都有可能引起免疫毒性反應(yīng)[2]。其中，皮膚和粘膜接觸可能誘發(fā)I型和IV型超敏反應(yīng)。不含免疫原物質(zhì)的器械與機體長時間接觸也有可能在機體內(nèi)產(chǎn)生免疫原，一般來說，接觸時間越長，產(chǎn)生的免疫原的可能性越大。與機體接觸24 h以上的器械發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)也可被認為是具有免疫原性。

1.1 超敏反應(yīng)

超敏反應(yīng)一般分為四種類型。常見的由醫(yī)療器械引發(fā)的超敏反應(yīng)主要有兩類。即由IgE抗體介導的Ⅰ型超敏反應(yīng)（速發(fā)型超敏反應(yīng)）和由T淋巴細胞介導的Ⅳ型超敏反應(yīng)（遲發(fā)型超敏反應(yīng)）。Ⅰ型超敏反應(yīng)也是最嚴重的超敏反應(yīng)。Ⅱ型和Ⅲ型超敏反應(yīng)涉及到抗體（IgG或IgM，但是沒有IgE）和補體，發(fā)生率相對較低，醫(yī)療器械一般不會發(fā)生這兩種超敏反應(yīng)。

1.2 慢性炎癥反應(yīng)

眾所周知，炎癥是局部損傷后的修復反應(yīng)，是機體的一種保護機制。其中，急性炎癥反應(yīng)一般持續(xù)時間較短，并伴有機體局部的紅腫熱痛和功能障礙。與急性炎癥反應(yīng)不同，慢性炎癥反應(yīng)一般可持續(xù)數(shù)月或更長時間，其特征為巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，并形成免疫性肉芽腫和更為嚴重的免疫毒性反應(yīng)，如自身免疫性疾病等。對于長期接觸或永久性植入物導致的慢性炎癥，還有可能導致植入物的成分與骨質(zhì)相連，形成致密的假性囊腔及其它嚴重后果。GB/T16886.6/ISO10993-6中對植入后局部炎癥反應(yīng)作出了詳細地描述[3]。

1.3 免疫抑制

免疫抑制可導致機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抑制，宿主抵抗力下降和經(jīng)常性的嚴重感染。截至目前，尚無器械/材料導致免疫抑制的確切證據(jù)，與免疫抑制相關(guān)的免疫毒理實驗還是僅限于一般的毒性測試階段。

1.4 免疫刺激

免疫刺激主要為器械/材料中的免疫原性成分刺激機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答(如抗體和/或淋巴細胞對外源蛋白的免疫應(yīng)答)。一般情況下，免疫刺激不會導致機體對疾病的抵抗力降低。然而，不適當?shù)目乖禺愋曰蚍翘禺愋源碳っ庖呦到y(tǒng)，有可能會加劇現(xiàn)有的過敏或自身免疫癥狀。

1.5 自身免疫

某些器械/材料接觸人體后，可與組織或血清蛋白結(jié)合，改變蛋白的構(gòu)象，使得機體可對這些修飾后的自身抗原進行識別，產(chǎn)生自身抗體或T淋巴細胞與宿主的自身抗原發(fā)生反應(yīng)，導致細胞損傷或組織破壞，并可能導致慢性、消耗性自身免疫性疾病，或重要組織和器官的損傷。自身免疫一般表現(xiàn)為較高的個體差異性，影響因素眾多，并且由于種屬間有差異性，很難用動物模型進行模擬。

2 含免疫原的醫(yī)療器械產(chǎn)品類型

在醫(yī)療器械的眾多組分中，蛋白質(zhì)作為免疫原性物質(zhì)的可能性最大，其次是多糖、核酸和脂質(zhì)。小分子量的物質(zhì)通常沒有免疫原性，然而，它們可以通過與宿主蛋白結(jié)合并改變蛋白的構(gòu)象來獲得免疫原性。生物源性的材料，如膠原，乳膠蛋白和動物組織中含有的免疫原都有可能刺激機體發(fā)生免疫應(yīng)答。常見的含免疫原的醫(yī)療器械主要包括以下幾種類型。

2.1 組織工程類產(chǎn)品和同種異體移植物

組織工程類產(chǎn)品和同種異體移植物是近年來發(fā)展較快的一類醫(yī)療器械類產(chǎn)品。機體針對該類產(chǎn)品發(fā)生的免疫毒性反應(yīng)主要為移植排斥反應(yīng)。其中，最常見的是同種異型移植排斥反應(yīng)，即由受者的T細胞介導的，針對該類產(chǎn)品中的免疫原進行的免疫應(yīng)答，主要涉及直接識別和間接識別兩種機制（見表1）。因此，組織工程類產(chǎn)品和同種異體移植物在加工過程中，除了要對潛在的病毒感染因子進行滅活以外，另一項很重要的工序就是去除或降低產(chǎn)品的免疫原性，減少產(chǎn)品使用過程中發(fā)生的急性和慢性排斥反應(yīng)，以保證產(chǎn)品發(fā)揮其預期的功能。

表1 直接識別和間接識別的比較Tab.1 Comparisons between direct recognition and indirect recognition

2.2 動物源類產(chǎn)品

醫(yī)療器械中來源于動物組織的材料非常范圍，這些材料可構(gòu)成器械的主要部分(如牛/豬心臟瓣膜、用于口腔科或整形外科的骨替代物、止血器械）、產(chǎn)品的涂層或浸滲（如膠原、明膠、肝素）或用于器械制造過程（如油酸鹽和硬脂酸鹽等動物脂衍生物、胎牛血清、酶、培養(yǎng)基）。這些產(chǎn)品在使用過程中，產(chǎn)品中殘留的動物組織蛋白、DNA以及包膜抗原等都可能會與患者的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生免疫毒理學效應(yīng)，其實質(zhì)也為機體免疫系統(tǒng)針對異種移植物的排斥反應(yīng)。因此需在加工過程中對其免疫原性進行清除或降低。

2.3 乳膠類產(chǎn)品

乳膠產(chǎn)品中由于含有乳膠蛋白質(zhì)，當人體接觸后，蛋白可選擇誘導特異性B細胞發(fā)生IgE抗體應(yīng)答，產(chǎn)生表面結(jié)合特異性IgE的致敏肥大細胞/嗜堿性粒細胞。當機體再次接觸相同的乳膠蛋白時，會與致敏肥大細胞/嗜堿性粒細胞表面的IgE抗體結(jié)合，從而引發(fā)Ⅰ型超敏反應(yīng)。目前已經(jīng)證實，天然乳膠中的幾種蛋白質(zhì)能與IgE結(jié)合，并可以引發(fā)Ⅰ型超敏反應(yīng)[4]。

2.4 聚合物、陶瓷制品及金屬

對于醫(yī)療器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金屬材料中潛在的可瀝濾物、磨損或可降解成分，可與宿主蛋白結(jié)合而具有免疫原性。以金屬材料為例，金屬醫(yī)療器械中可引起超敏反應(yīng)的金屬有很多種，主要有鎳、鈷、鉻、汞等。其中，鎳所引起的金屬過敏最為常見。鎳可極少量溶解于人的體液中，并與組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合，改變組織蛋白的構(gòu)象，從而被機體的抗原遞呈細胞識別、加工和處理，以抗原肽和MHC-II/I類分子復合物的形式表達于抗原遞呈細胞表面，進而活化具有相應(yīng)抗原受體的CD4+T細胞和CD8+T細胞，并在細胞因子作用下增殖分化為效應(yīng)T細胞或記憶性T細胞。當記憶性T細胞再與鎳蛋白復合物接觸后，即可迅速增殖分化為效應(yīng)T細胞，從而引發(fā)Ⅳ型超敏反應(yīng)。同時，有些金屬（如鎳和汞）也可能在某些受試者體內(nèi)引發(fā)免疫抑制，但具體機制不詳。

3 醫(yī)療器械免疫原性評價策略

當前生物相容性試驗中免疫原性方面的知識非常有限的。一方面缺少簡單、可靠和敏感的方法。另一方面，雖然有些免疫學實驗已被證實為有效的方法，但是在許多情況下，其生物學意義和預示價值仍需要慎重考慮。與其他醫(yī)療器械生物相容性試驗相似，免疫原評價方法也分為體外試驗、半體內(nèi)試驗和動物試驗三種方式。其中，最為重要的就是通過在嚙齒類動物體內(nèi)試驗的方法來研究和評價材料的免疫學效應(yīng)。同樣，在進行動物實驗時，為了與GB/T 16886.2/ISO 10993-2中的要求一致，我們需要考慮到所有可能的和實際上能做到的替代方法[5]。從試驗性質(zhì)上看，免疫原評價的方法又可分為非功能性試驗和功能性試驗兩種類型。預期構(gòu)建的免疫原性評價的框架如圖1所示。

圖1 免疫原性評價的框架Fig.1 Framework for immunogenic evaluation

3.1 非功能性試驗

非功能性試驗主要是針對免疫器官重量，大體形態(tài)，淋巴組織的改變程度，淋巴細胞的數(shù)量和免疫球蛋白的水平以及其他免疫功能指標水平的改變加以描述。它是目前采用廣泛的評價方法。

3.2 功能性試驗

非功能試驗具有易操作、檢測迅速的特點，然而，要想全面客觀的評價醫(yī)療器械的免疫毒性，就必須進行相關(guān)的功能性試驗研究。功能性試驗是用來檢測細胞和/或器官的活性，大體分為體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答兩大類。前者常見的試驗有使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對免疫球蛋白功能的檢測以及補體活性的檢測。后者常見的試驗有淋巴細胞對絲裂原或特異性抗原的增殖反應(yīng)，混合淋巴細胞反應(yīng)，自然殺傷（NK）細胞的活性以及致敏試驗等。

4 結(jié)語

目前，醫(yī)療器械導致人體潛在免疫毒性作用方面的全身研究是非常缺乏的，部分原因可能是因為在材料的早期研發(fā)階段就已經(jīng)進行了免疫原性的篩選。但是，缺乏科學、完整的適用于醫(yī)療器械免疫原性評價程序和試驗方法學標準體系也是不容忽視的原因。同時，隨著大量新型醫(yī)療器械的不斷涌現(xiàn)，以及新的免疫學技術(shù)如流式細胞術(shù)、蛋白質(zhì)組學及基因芯片技術(shù)等在醫(yī)療器械免疫原性評價中的應(yīng)用，使我們對醫(yī)療器械中免疫原的識別以及其基本分子結(jié)構(gòu)進行定性分析成為可能。相信將來也一定會形成一套能有效保證醫(yī)療器械免疫原性安全的檢測方法學標準體系。

[1] ISO/TS 10993-20:2006, Biological evaluation of medical devices–Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical device [S].

[2] ISO 10993-1:2009, Biological evaluation of medical devices–Part 1: Evaluation and testing within a risk management process [S].

[3] ISO 10993-6:2007, Biological evaluation of medical devices-Part 6:Tests for local effects after implantation[S].

[4] Akasawa A, Hsieh L-S, Lin Y, Serum reactivities to latex proteins(Hevea brasiliensis)[S]. J Allergy Clin Immunol 1995, 95:1196-1205.

[5] ISO 10993-2:2006, Biological evaluation of medical devices-Part 2:Animal welfare requirements[S].