煙草突變體篩選與鑒定方法篇：3.煙草突變體的TILLING篩選與功能鑒定

李鳳霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

TILLING（targeting induced local lesions in genomes,定向誘導(dǎo)基因組局部突變）是利用單核苷酸多態(tài)性篩選突變體的一種全新反向遺傳學(xué)方法，該方法首先通過化學(xué)誘變產(chǎn)生高頻率點(diǎn)突變，再利用點(diǎn)突變篩選技術(shù)如毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis,CE）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）、瓊脂糖電泳（agarose gel electrophoresis,AGE）、高分辨熔解曲線（high-resolution melting,HRM）以及高通量測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing）等方法將點(diǎn)突變篩選出來，具有高通量、低成本的技術(shù)特點(diǎn)。隨著煙草全基因組測(cè)序的完成，TILLING在煙草功能基因組學(xué)中的重要價(jià)值也越發(fā)體現(xiàn)出來。

1 TILLING檢測(cè)的分析群體構(gòu)建

適度突變是構(gòu)建優(yōu)質(zhì)突變體群體一個(gè)極為重要的參數(shù)，一般要求誘變種子M1代萌發(fā)率在30%～80%[1]。M2代群體一般采用M1代單粒傳法構(gòu)建。

TILLING檢測(cè)需要一定的群體規(guī)模，所需群體大小與該植物的倍性有很大關(guān)系，由于多倍體能忍耐更高水平的突變劑量，多倍體的突變頻率要顯著高于二倍體，如二倍體植物擬南芥、水稻、玉米的突變頻率分別為1/170 kb、1/500 kb、1/485 kb，而多倍體植物普通小麥突變頻率1/24 kb，普通煙草約為1/66 kb，因此要使基因組中95%以上的基因都有突變信息，多倍體植物如普通小麥TILLING檢測(cè)群體很少超過5000株系，而二倍體的群體經(jīng)常需要上萬株系[2]。

2 目標(biāo)基因的生物信息學(xué)

TILLING 技術(shù)作為一種全新的反向遺傳學(xué)方法，在應(yīng)用于擬南芥突變體篩選時(shí)可達(dá)到一年內(nèi)篩選超過100個(gè)基因，獲得1000多個(gè)不同擬南芥等位變異體，這種高效率得益于擬南芥較為簡(jiǎn)單的基因組結(jié)構(gòu)以及擬南芥全基因測(cè)序的完成。

由于植物基因組信息龐大，對(duì)目標(biāo)基因的挑選至關(guān)重要，這就需要通過生物信息學(xué)的手段挑選目標(biāo)基因。其一，基因冗余現(xiàn)象在真核生物特別是多倍體植物中非常普遍。對(duì)于冗余的基因，往往需要同時(shí)篩選相似性較高的幾個(gè)或幾十個(gè)基因。其二，每個(gè)基因結(jié)構(gòu)和大小并不相同，基因和基因之間互成網(wǎng)絡(luò)，相互依賴關(guān)系緊密，往往需要挑選轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子作為優(yōu)先的目標(biāo)篩選基因，因?yàn)樗烧{(diào)節(jié)幾個(gè)或幾十個(gè)基因的表達(dá)。其三，由于每個(gè)基因的結(jié)構(gòu)不同，而 TILLING片段長度和成本的限制，常常挑選較保守的區(qū)域或功能結(jié)構(gòu)域作為篩選目標(biāo)片段。

3 引物設(shè)計(jì)

在 TILLING檢測(cè)中，引物設(shè)計(jì)的質(zhì)量直接影響突變篩選結(jié)果，所以在確立所要篩選的目標(biāo)區(qū)段后，如何根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物就成為TILLING的一個(gè)重要方面。一般引物設(shè)計(jì)在CODDLE（codons optimized to discover deleterious）程序中進(jìn)行，CODDLE能識(shí)別各種形式的序列信息，并能根據(jù)輸入的堿基序列產(chǎn)生基因模型和蛋白質(zhì)保守區(qū)模型，當(dāng)1000 bp被選中后，系統(tǒng)會(huì)根據(jù)最有可能突變成高頻率終止密碼子的區(qū)域或進(jìn)化保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物。

4 突變體檢測(cè)

基因片段中的點(diǎn)突變檢測(cè)一般通過以下步驟進(jìn)行：（1）突變?nèi)后w基因組DNA分離、DNA樣品定量分析及濃度均一化、構(gòu)建不同混樣倍數(shù)的DNA池；（2）PCR擴(kuò)增、異源雙鏈重組；（3）CELI 酶切異源雙鏈核酸分子；（4）電泳檢測(cè)，檢測(cè)手段可通過產(chǎn)生真實(shí)電泳圖譜的 LICOR4300遺傳分析工作站進(jìn)行，也可通過自動(dòng)化程度較高的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行；（5）采取相同的方法從突變池中篩選突變個(gè)體；（6）突變個(gè)體PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證。

5 突變基因功能驗(yàn)證

一旦點(diǎn)突變被發(fā)現(xiàn)后，對(duì)引起編碼蛋白功能損傷的突變就要進(jìn)行表型分析。但化學(xué)誘變一般要引入大量點(diǎn)突變，如水稻誘變M2代群體中，每個(gè)突變體的突變密度約為1075個(gè)點(diǎn)突變，普通煙草約為68 000個(gè)點(diǎn)突變，這使得表型分析變得相對(duì)困難，尤其對(duì)功能未知的基因。如果突變體有表型變化，需要以下三種方法進(jìn)行表型鑒定：第一是將兩個(gè)獨(dú)立突變位點(diǎn)的個(gè)體雜交，分析其后代的基因型和表型；第二是將突變體與野生型雜交后回交，觀測(cè)突變性狀與基因型的共分離情況；第三是通過對(duì)目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化，看能否使突變體的表型得以恢復(fù)，從而將表型與目的基因聯(lián)系起來。

鑒定異源多倍體植物基因功能時(shí)，最主要是需要克服因多倍體帶來的基因多拷貝。擬南芥基因組中單拷貝基因（多數(shù)都是）[3]，其對(duì)應(yīng)的DNA編碼區(qū)域在芥菜型和白菜型油菜基因組中有3個(gè)左右的拷貝[4-5]，在甘藍(lán)型油菜基因組的功能基因一般維持4個(gè)左右的拷貝[6]。這樣，單一基因的突變可能對(duì)表型的變化影響不易檢測(cè)出來，這時(shí)，可篩選其不同拷貝基因的突變體，通過二突或者多突的方式鑒定基因功能。

另外，在基因功能分析時(shí)還需要注意其等位基因?qū)υ摶蚬δ艿挠绊?。如在研究大麥棱型時(shí)，發(fā)現(xiàn)這一性狀主要由Vrs位點(diǎn)的HvHox1基因控制，但對(duì)獲得的同一位點(diǎn)突變的HvHox1突變體分析發(fā)現(xiàn)，等位基因int-c的差異影響著表型變化[7]，即突變體表型變化還與目標(biāo)基因的等位基因有關(guān)。

成功鑒定突變基因功能尚需要QTL、轉(zhuǎn)錄組、代謝組以及生理學(xué)等技術(shù)手段獲得相應(yīng)目的基因信息，尤其對(duì)于多倍體植物突變體鑒定。如Slade研究小組[8]通過單體分析和QTL等數(shù)據(jù)信息發(fā)現(xiàn)控制四倍體小麥糯性即直鏈淀粉合成的Waxy基因有兩個(gè)拷貝，進(jìn)而通過TILLING在近1920份M2代突變體庫材料中篩選到一系列從野生的到無效的246個(gè)Waxy等位基因，從中選出這兩個(gè)拷貝功能都缺失的突變單株，該單株達(dá)到了理想的直鏈淀粉和支鏈淀粉比例。在研究蕓苔屬芥酸合成代謝中，多個(gè)研究小組通過定位蕓苔屬中與芥酸相關(guān)的QTL，發(fā)現(xiàn)脂肪酸延長基因（FAE1）與芥酸合成之間的高度關(guān)聯(lián)性，汪念[9]進(jìn)一步篩選甘藍(lán)型油菜基因BAC文庫，獲得了芥酸合成過程中兩個(gè)拷貝的FAE1基因，進(jìn)而改進(jìn)引物設(shè)計(jì)思路，篩選出了多個(gè)FAE1突變體，其中部分突變體芥酸含量較低。

6 展 望

迄今為止，TILLING技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用在水稻、玉米、小麥、大麥、百脈根、大豆、花生等植物突變體篩選中，對(duì)基因功能的挖掘起到了至關(guān)重要的作用。針對(duì)煙草相對(duì)較高的突變頻率，如何消除多突變點(diǎn)背景、基因冗余、多拷貝等影響，是一個(gè)值得深入研究的問題。

[1]Wang T,Uauy C,Till B,et al.TILLING and associated technologies[J].J Integr Plant Biol,2010,52:1027-1030.

[2]Chawade A,Sikora P,Brautigamet M,et al.Development and characterization of an oat TILLING-population and identification of mutations in lignin and beta-glucan biosynthesis genes[J].BMC Plant Biol,2010,10:86.

[3]Bouchez D,Hofte H.Functional genomics in plants[J].Plant Physiol,1998,118:725-732.

[4]Haberer G,Mader M T,Kosarev P,et al.Large-scale cis-element detection by analysis of correlated expression and sequence conservation between Arabidopsis and Brassica oleracea[J].Plant Physiol,2006,142:1589-1602.

[5]Town C D,Cheung F,Maiti R,et al.Comparative genomics of Brassica oleracea and Arabidopsis thaliana reveal gene loss,fragmentation,and dispersal after polyploidy[J].Plant Cell,2006,18:1348-1359.

[6]Udall J A,Wendel J F.Poluploidy and crop improvement[J].Crop Sci,2006,46:3-13.

[7]Gottwald S,Bauer P,Komatsuda T,et al.TILLING in the two-rowed barley cultivar 'Barke' reveals preferred sites of functional diversity in the gene HvHox1[J].BMC Res Notes,2009,2:258.

[8]Slade A J,Fuerstenberg S I,Loeffler D,et al.A reverse genetic,nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING[J].Nat Biotechnol,2005,23:75-81.

[9]汪念.甘藍(lán)型油菜EMS突變體庫的構(gòu)建及TILLING、EcoTILLING技術(shù)的應(yīng)用研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.