WRKY轉(zhuǎn)錄因子在防御反應(yīng)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及其功能研究概況

王春玲，徐祥彬，潘園園，應(yīng)奇才，王慧中

(杭州師范大學 生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036)

在長期的進化中，植物形成了一系列抵御生物和非生物脅迫逆境的防衛(wèi)反應(yīng)機制。WRKY家族是近年來發(fā)現(xiàn)的植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在防衛(wèi)反應(yīng)中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。WRKY家族最顯著的特點是至少含有一段大約60個氨基酸的WRKY結(jié)構(gòu)域，在其N端有保守的WRKYGQK序列，在C末端有一個鋅指結(jié)構(gòu):C2-H2或 C2-HC。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的組成可以將WRKY家族分為3類。Ⅰ類有2個WRKY結(jié)構(gòu)域，且有C2-H2的鋅指結(jié)構(gòu)。Ⅱ類只有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)與Ⅰ類相同，大多數(shù)發(fā)現(xiàn)的WRKY因子屬于這一類。Ⅲ類也只有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指結(jié)構(gòu)為C2-HC。當植物受到病原菌和SA等因子的誘導(dǎo)后，WRKY轉(zhuǎn)錄因子就會迅速表達積累，并與抗病相關(guān)基因上的 (T) (T)TGAC(C/T)序列 (W-box)特異性結(jié)合，從而啟動防御，形成了一個復(fù)雜的WRKY調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 植物天然免疫系統(tǒng)

植物先天性免疫系統(tǒng)包括相互關(guān)聯(lián)的2個分支，即病原相關(guān)分子模式 (PAMP)激發(fā)的免疫反應(yīng) (PAMP-triggeredimmunity，PTI)和效應(yīng)子(effector)激發(fā)的免疫反應(yīng) (effector-triggered immunity，ETI)，這2種免疫啟動了高通量的轉(zhuǎn)錄重組。PAMPs是指病原微生物上有共同特征的分子，如鞭毛素、糖蛋白、脂多糖等，它能與植物細胞表面受體相識別，激活下游不同的信號途徑，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。許多微生物分泌的有毒的effector進入宿主細胞，植物抗病蛋白 (R蛋白)能與其專一性識別進一步激活了防御反應(yīng)。在擬南芥和其他高級植物中，PTI和ETI途徑受不同防御反應(yīng)途徑調(diào)控，包括水楊酸 (SA)和茉莉酸 (JA)等激素信號網(wǎng)絡(luò)所介導(dǎo)的抗病防御反應(yīng)途徑［1］。

大多數(shù)病原體激發(fā)了一個常規(guī)的相互聯(lián)系的植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與了植物的免疫反應(yīng)，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控和抗病防御反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控子［2－3］。在擬南芥中，大量協(xié)同調(diào)控的防御基因啟動子上WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點 (C/TTGACC/T，W盒)的存在，為鋅指型 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控防御反應(yīng)過程中起到廣泛而重要的作用提供了旁證。

2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物防御反應(yīng)中的作用

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子家族之一，是抗病防御反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控子，防衛(wèi)反應(yīng)信號傳遞網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分［4］。AtWRKY70的功能缺失易遭受Erysiphe cichoracearum和Botrytis cinerea等真菌類的侵害，遭受Erwinia carotovora和Pseudomomonassyringae等細菌類的侵害。AtWRKY70是基礎(chǔ)防御反應(yīng)和完整的R基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)，以抵抗Hyaloperonospora卵菌疫病侵襲所必需的調(diào)控因子［5－6］。AtWRKY52/RRS1 賦予擬南芥對Ralstonia solanacearum的抗性，但編碼的蛋白質(zhì)可作一種R蛋白［7］。AtWRKY33的突變使擬南芥更易遭受B．cinerea和Alternaria brassicicola感染［8］。WRKY可作負調(diào)控子，在AtWRKY7和AtWRKY11/AtWRKY17突變體中，受有毒P．syringae菌株激發(fā)的植物基礎(chǔ)抗性免疫反應(yīng)加強［6］。

AtWRKY18，AtWRKY40和AtWRKY60在調(diào)控植物抗病反應(yīng)過程中具有重要的功能。Xu等［9］發(fā)現(xiàn)AtWRKY18/AtWRKY40和AtWRKY18/AtWRKY60的雙突變體更耐P．syringaeDC3000的侵襲，但更易感染B．cinerea，AtWRKY18/AtWRKY40雙突變體也高效的抵抗有毒粉狀霉菌Golovinomyces orontii。這些結(jié)果表明在植物防御反應(yīng)中WRKY因子有著正調(diào)控和負調(diào)控的作用。與此相一致，AtWRKY18單獨過量表達導(dǎo)致了植物對P．syringae基礎(chǔ)免疫反應(yīng)的加強，而AtWRKY18與其他ⅡaWRKY成員一起過量表達與此結(jié)果完全相反。有2個WRKY因子 (AtWRKY53和AtWRKY58)已被確定為SAR的調(diào)控子，其中 AtWRKY53為正調(diào)控子，AtWRKY58 為 負 調(diào) 控 子［10］。在 擬 南 芥 中，將AtWRKY48的T-DNA插入突變體和過量表達植株感染細菌病原體P．syringae，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在插入突變體中，SA調(diào)控的PR1的誘導(dǎo)表達增加，提高了植物的抗病性，而在過表達植株中，由于PR基因表達減少，增強了P．syringae的生長和對該病原菌的敏感性。因此，對于PR基因的表達和對P．syringae的基礎(chǔ)抗性來說，AtWRKY48是一個負調(diào)控因子［11］。AtWRKY3和 AtWRKY4對壞死營養(yǎng)型病原體抗性反應(yīng)起積極作用，而在抗活體營養(yǎng)型病原體時，WRKY4對其產(chǎn)生消極作用［12］。

水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子在抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。如OsWRKY53和OsWRKY71的過量表達能夠促進防御反應(yīng)相關(guān)基因，包括病原相關(guān)蛋白基因如PBZ1的表達，并且增強了水稻對Magnaporthe grisea的抗性，表明水稻OsWRKY53/71在誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的防御信號途徑中起著重要作用。水稻Xa21基因賦予水稻對Xanthomonas oryzae pv．oryzae(Xoo)的抗性，轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY62因子能與Xa21相結(jié)合并表達2種蛋白質(zhì)，分別是OsWRKY62.1和 OsWRKY62.2。在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達OsWRKY62.1就會消弱植物基礎(chǔ)防御反應(yīng)，而過量表達OsWRKY62.2就會抑制防御相關(guān)基因的表達激活，因此在水稻自然免疫中OsWRKY62作為一個負調(diào)控子，為水稻基礎(chǔ)防御反應(yīng)和特異防御反應(yīng)的關(guān)鍵介導(dǎo)子［13］。在SA介導(dǎo)的防御信號體系中，WRKY45起正調(diào)控作用，能提高水稻的抗病性。OsWRKY31基因的過量表達能增強水稻抗M．grisea的感染，同時引起下游防御相關(guān)基因如PBZ1等的組成型表達，可能是生長素效應(yīng)和防御反應(yīng)信號轉(zhuǎn)換途徑的一個作用元件［14］。

3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守的結(jié)構(gòu)序列及防御作用

WRKY轉(zhuǎn)錄因子除了WRKY結(jié)構(gòu)域的核心序列之外還有一些保守的結(jié)構(gòu)特點。這些結(jié)構(gòu)很可能功能性地將單個的WRKY分子彼此連接起來或者將單個的WRKY分子與另外的防御性信號元件連接起來。WRKY25和WRKY33因子的D motif是保守的，能通過核定位的耦合因子MKS1介導(dǎo)而被MPK4磷酸化，MPK4是一種抑制水楊酸信號途徑的MAP激酶，這種保守的D motif存在于許多Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子的N末端。D motif的一個顯著特點是有一個保守的Ser-Pro二聚體分子模式，它是受MAP激酶磷酸化的優(yōu)先位點。煙草Ⅰ類WRKY因子，含有D motif的NtWRKY1因子能被SIPK因子磷酸化［15］。在體外，SIPK介導(dǎo)的磷酸化能增強W盒與NtWRKY1的結(jié)合活性，SIPK與NtWRKY1的協(xié)同表達導(dǎo)致植物快速的過敏反應(yīng)。

擬南芥Ⅱa WRKY蛋白的N端亮氨酸拉鏈基序介導(dǎo)這種類型成員之間的同源二聚化或異源二聚化。在體外Ⅱa代表成員:水稻的OsWRKY71，大麥的HvWRKY1和HvWRKY2被發(fā)現(xiàn)能夠進行同源性連接［16］。環(huán)境條件，突變體，或者過量表達引起的集中干擾能夠影響不同ⅡaWRKY二聚體之間的平衡，因此改變了植物體-病原體互作的結(jié)果。

在Ⅱd WRKY成員中發(fā)現(xiàn)保守的Cmotif，構(gòu)成一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合域，能感知病原體引發(fā)的細胞內(nèi)Ca2+水平的波動并作出反應(yīng)。還有獨立于 WRKY區(qū)域的鋅簇，其嚴格保守的殘基序能加強WRKY因子與 DNA的親和力。AtWRKY7和 AtWRKY11作為轉(zhuǎn)錄抑制子與其保守結(jié)構(gòu)特點密切相關(guān)［17］。

4 WRKY網(wǎng)絡(luò)存在的證據(jù)

植物免疫反應(yīng)與大量不同的WRKY轉(zhuǎn)錄體和蛋白質(zhì)協(xié)同一致的調(diào)節(jié)相聯(lián)系。在擬南芥中，SA依賴的防御反應(yīng)一旦激發(fā)，至少有49個AtWRKY基因表現(xiàn)了差異表達［6］。利用擬南芥突變體研究發(fā)現(xiàn)，WRKY基因能積極或消極的影響其他基因家族成員的表達［18］。水稻在非生物脅迫和激素處理條件下，有54個WRKY基因在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)了極大的不同，其中有28個基因受這2種處理方式調(diào)控，表明在非生物脅迫和激素信號途徑之間也有WRKY因子相互作用［19］。在油菜中，大量的BnWRKY蛋白參與了真菌病原體和激素刺激引起的防御反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［20］。以上說明，WRKY基因通過自主調(diào)控和交叉調(diào)控機制來進行功能性的連接，它們形成了基因轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的核心，這個網(wǎng)絡(luò)伴隨著其它信號元件，控制大量的抗病基因。此外，這個WRKY網(wǎng)絡(luò)由正調(diào)控和負調(diào)控元件構(gòu)成，這些元件能讓防御信號有效且不失均衡的擴增和多樣化［6］。

5 WRKY因子構(gòu)成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)

病原菌上的PAMP與PRR的識別激發(fā)了細胞防御信號，引發(fā)了 MAPK級聯(lián)反應(yīng)［21］。經(jīng)過不同的蛋白激酶磷酸化反應(yīng)，含有 D motif的Ⅰ類WRKY因子首先被蛋白激酶MPK4磷酸化，激活的WRKY因子一方面調(diào)節(jié)SA和JA依賴的免疫反應(yīng)之間的平衡，另一方面WRKY因子也與自身的W盒結(jié)合，從而促進抗病基因的表達，進行防御反應(yīng)。病原誘導(dǎo)性的ICS1基因的表達激發(fā)了SA的產(chǎn)生，ICS1基因可能是WRKY因子的一個靶基因，因為ICS1的啟動子有豐富的W盒。SA的產(chǎn)生使細胞質(zhì)內(nèi)低聚化的NPR1解聚，NPR1進入細胞核內(nèi)。對于NPR1，一部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子是它的轉(zhuǎn)錄靶目標，同時其本身也受WRKY因子調(diào)節(jié)表達。像8種WRKY基因 (AtWRKY18，－38，－53，－54， －58， －59， －66和 －70)都是 NPR1的靶基因，NPR1與TGA轉(zhuǎn)錄因子在基因的啟動子位點相互作用，促進這些WRKY因子的表達，進一步啟動下游抗病基因的表達，其中WRKY70能促進SA依賴的抗病基因的表達，抑制JA依賴性的抗病基因的表達。病原菌分泌的效應(yīng)子如AVR一旦進入細胞便迅速與抗性蛋白 (R蛋白)識別，激活的R蛋白激發(fā)了ETI途徑，最終獲得抗病性。同時效應(yīng)子與一些WRKY因子相互作用，進一步抑制了PAMP依賴的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)，這種負反饋機制似乎提供了PTI與ETI之間的功能型接口［16］，與 PTI相比，ETI對病原菌防御反應(yīng)更快，作用更強。

作為對PAMP處理的反應(yīng)，PcWRKY1轉(zhuǎn)錄體快速的積累，AtWRKY33和 OsWRKY53能夠被相關(guān)刺激激活并參與防御反應(yīng)，這種快速的反應(yīng)是通過3種協(xié)同作用的W盒的保守排列介導(dǎo)的［22］。通過免疫沉淀反應(yīng)和基因組微陣列，AtWRKY51被確定作為一個潛在的SA依賴性的TGA2的下游靶蛋白［23］。擬南芥AtWRKY62能夠被 SA和 MeJA 2種物質(zhì)協(xié)同誘導(dǎo)表達，AtWRKY62的基因敲除突變體和過量表達植株顯示，AtWRKY62能啟動下游NPR1的表達，而NPR1能夠促進SA免疫途徑并抑制JA途徑［24］。對 T-DNA插入突變體中和轉(zhuǎn)基因過表達株系進行分析，WRKY25是P．syringae引起的SA介導(dǎo)的防御反應(yīng)的一個負調(diào)控子［25］。熱脅迫誘導(dǎo)的AtWRKY39能調(diào)控SA和JA信號途徑之間的協(xié)同作用，提高了擬南芥的耐熱性，AtWRKY25 在耐熱性方面也發(fā)揮了作用［26－27］?？梢奧RKY轉(zhuǎn)錄因子在PAMP激發(fā)轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)的不同層次進行工作，并與 ETI激發(fā)途徑，SA、JA等獲得性免疫途徑有著密切聯(lián)系，表明WRKY網(wǎng)絡(luò)具有復(fù)雜和廣泛性特點。

6 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能多樣性

WRKY家族在非生物脅迫，衰老，損傷等方面也具有不同的調(diào)控作用。WRKY75是第一個被報道的參與營養(yǎng)物質(zhì)匱乏調(diào)控和根生長發(fā)育的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。WRKY3和WRKY6調(diào)控植物響應(yīng)植食性昆蟲對植物造成的損傷。WRKY34是花粉特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對于冷脅迫下花粉的生長發(fā)育和成熟具有重要調(diào)控作用［28］。OsWRKY80是在水稻中發(fā)現(xiàn)的由于Fe過量而誘導(dǎo)產(chǎn)生的脅迫應(yīng)答基因［29］。OsWRKY72能夠干擾ABA信號和生長素運輸途徑之間的相互作用［30］。OsWRKY08獨立于ABA信號途徑能提高擬南芥的滲透脅迫耐受性［31］。NtWRKY4參與了煙草葉子形態(tài)的構(gòu)建及抗病毒 (TMV)防御反應(yīng)?？梢?，WRKY因子參與了植物許多生理過程，隨著研究深入，WRKY因子的其他功能也會被發(fā)現(xiàn)。

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