高壓氧對(duì)腦卒中后大鼠神經(jīng)功能的作用

馬明明 王雪晶 李 瑋 張杰文△

1）河南省人民醫(yī)院 鄭州 450003 2）鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

缺血性腦血管病是一類嚴(yán)重危害人類健康的常見病，具有發(fā)病率、病死率、致殘率、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)［1］。雖然超早期溶栓和急性期神經(jīng)元保護(hù)取得重要進(jìn)展，但對(duì)于大多數(shù)患者而言，腦卒中后癱瘓肢體的康復(fù)仍不理想。為探討高壓氧治療對(duì)急性缺血性腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響，本研究選取SD大鼠成功建立線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞模型，在術(shù)后3h對(duì)HBO組大鼠開始高壓氧治療。梗死后5d、10d、14d以橫木行走試驗(yàn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，同時(shí)進(jìn)行TTC染色與梗死體積測(cè)量。觀察高壓氧對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和梗死灶體積的影響，為進(jìn)一步研究HBO治療機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠48只，均為雄性，鼠齡3～4個(gè)月，體質(zhì)量（315±20）g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，檢疫后備用。

1.1.2 儀器和試劑：YC32190／0.3－22型高壓氧艙系煙臺(tái)冰輪高壓氧艙有限公司生產(chǎn)，10%水合氯醛由河南省人民醫(yī)院藥劑科配置；4%多聚甲醛購(gòu)自天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品有限公司。TTC（triphenyltetrazolium chloride，氯化三苯四唑）染色試劑購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組：將48只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、HBO組，每組16只。①假手術(shù)組：僅分離頸總及頸外動(dòng)脈，不插入尼龍線結(jié)扎大腦中動(dòng)脈；②模型組：只造模，不做其他處理；③HBO組：造模后進(jìn)行高壓氧治療。

1.2.2 模型制備：將模型組及 HBO組大鼠32只用線栓法［2］制成大腦中動(dòng)脈梗死模型。在大鼠頸外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處剪一小口，將尼龍線（直徑0.188mm）順勢(shì)緩慢插入大腦中動(dòng)脈，栓塞大腦中動(dòng)脈起始端的血流，然后以尼龍線結(jié)扎頸總動(dòng)脈。如大鼠蘇醒后向右旋轉(zhuǎn)或右側(cè)肢體癱瘓則視為栓堵成功并入選實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 高壓氧處理：術(shù)后3h動(dòng)物進(jìn)艙，先用純氧充分洗艙30min，新鮮鈉石灰顆粒吸收CO2。按100kPa（1ATA）／min速率加壓至0.25MPa，在高壓下停留1h，后以0.25ATA／min速度勻速減壓至常壓并出艙活動(dòng)，隔天1次，共暴露8次［2］。假手術(shù)組及模型組大鼠在同時(shí)段模擬進(jìn)出艙活動(dòng)。

1.2.4 大鼠肢體功能評(píng)分：在大腦中動(dòng)脈梗死術(shù)后第5、10、14天對(duì)模型組及HBO組大鼠進(jìn)行橫木行走試驗(yàn)（beam walking test，BWT）評(píng)分法［3］，以判斷肢體功能恢復(fù)的程度。

1.2.5 TTC染色和梗死灶體積測(cè)量：假手術(shù)組、模型組和HBO組術(shù)后24h與梗死后5d、10d、14d每組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組大鼠取3只立即斷頭取腦，剝離血管和硬腦膜后，觀察梗死灶外觀。置于2%TTC溶液中，37℃避光恒溫箱孵育30min，取出腦，放在－20℃冰箱10 min。待腦組織稍硬后，使用鋒利刀片，由腦的前極向后極冠狀切片，片厚約2mm，再置于2%TTC溶液中，37℃避光溫育30min，然后轉(zhuǎn)移至用PBS配置的4%多聚甲醛中固定。取最大層面，觀察梗死灶面積，計(jì)算腦缺血梗死體積，并觀察神經(jīng)元損傷情況，計(jì)算其占據(jù)左半球的百分比。照片掃描后用Leica圖像處理系統(tǒng)測(cè)定切片的腦梗死面積，利用既往公式［4］算出梗死區(qū)及缺血對(duì)側(cè)腦片體積，利用梗死體積百分比（梗死體積／對(duì)側(cè)腦片體積×100%）表示損傷程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析和t檢驗(yàn)，比較模型組、對(duì)照組和HBO組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肢體功能評(píng)分和梗死灶體積，以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后大鼠肢體功能評(píng)分 按照平衡木試驗(yàn)評(píng)分，結(jié)果如表1所示。術(shù)后第5天模型組與HBO組評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組與 HBO組肢體功能恢復(fù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后第10、14天模型組與HBO組評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HBO組肢體功能恢復(fù)較模型組好。HBO組及模型組術(shù)后第10天評(píng)分較第5天評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第10天肢體功能較第5天有所改善；術(shù)后第14天評(píng)分較第10天評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第14天肢體功能均較第10天有所改善。見表1。

表1 2組腦梗死大鼠平衡木試驗(yàn)評(píng)分比較 （）

表1 2組腦梗死大鼠平衡木試驗(yàn)評(píng)分比較 （）

注：與 HBO 組相比，＊P＜0.05；與第5天相比，＃P＜0.05；與第10天相比，△P＜0.05

14d組別 肢體功能評(píng)分術(shù)后5d 術(shù)后10d 術(shù)后△＊△模型組 4.43±0.22 3.20±0.36＊＃ 2.80±0.14 HBO組 4.38±0.34 2.41±0.36＃ 2.05±0.31

表2 2組大鼠腦梗死體積比較 （）

表2 2組大鼠腦梗死體積比較 （）

注：與 HBO組相比，＊P＜0.05；與第5天相比，＃P＜0.05

14d組別 腦梗死體積／%術(shù)后5d 術(shù)后10d 術(shù)后＊模型組 36.58±4.49 29.85±3.64＊＃ 26.48±4.46 HBO組 39.54±5.95 23.47±4.36＃20.59±5.25

2.2 梗死灶體積 TTC染色顯示大鼠左側(cè)大腦出現(xiàn)梗死灶，梗死區(qū)域神經(jīng)元大量死亡，染色較淡。梗死灶以額葉、頂葉、顳葉大腦皮質(zhì)為主。用TTC染色分析的方法［4］對(duì)不同時(shí)期梗死體積進(jìn)行測(cè)量。假手術(shù)組無(wú)梗死灶形成。如表3所示，模型組、高壓氧組在腦梗死后無(wú)顯著差異，從MCAO后24 h開始進(jìn)行不同刺激，于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從第5天開始，高壓氧組梗死體積均較模型組明顯縮?。≒＜0.05），此現(xiàn)象一直持續(xù)至第14天。不同時(shí)間點(diǎn)上看，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，梗死灶體積逐漸減少，但第14天和第10天相比2組梗死灶體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

高壓氧治療急性缺血性腦卒中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，HBO治療急性缺血性腦卒中模型，特別是缺血再灌注模型療效顯著，而對(duì)于大血管永久性阻塞模型的療效還有爭(zhēng)議［5－6］。目前研究證實(shí)，高壓氧治療急性缺血性腦卒中的機(jī)制有多種：高壓氧可通過改善缺血細(xì)胞代謝，清除氧自由基以及保護(hù)梗死周圍缺血半暗帶組織等改善腦梗死的預(yù)后［7－9］。但目前大多數(shù)臨床觀察還未充分證實(shí)急性腦梗死后高壓氧治療的有效性［10］。

本研究以線栓法成功制作大腦中動(dòng)脈閉塞模型，術(shù)后3 h開始給予多次高壓氧治療，發(fā)現(xiàn)梗死后第10、14天高壓氧組比模型組的神經(jīng)功能恢復(fù)更加明顯，證實(shí)早期開始高壓氧治療能夠改善大腦中動(dòng)脈永久閉塞大鼠神經(jīng)功能，與Yin等［11］報(bào)道一致。用TTC染色方法，對(duì)不同時(shí)期梗死體積進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從第5天開始，高壓氧組梗死體積明顯縮?。≒＜0.05），此現(xiàn)象一直持續(xù)至第4周；從第5天開始2組梗死體積均較刺激前明顯縮小，但第14天與第10天相比梗死灶體積仍然減小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？赡芤?yàn)镸CAO第5天大鼠的組織水腫較明顯，由于高壓氧的干預(yù)，可明顯減輕組織水腫程度，從而明顯減輕梗死灶體積。而在第14天，各組梗死灶體積和第10天已無(wú)明顯差距，說(shuō)明第2周梗死區(qū)域已發(fā)生軟化壞死，梗死灶體積無(wú)顯著改變。這提示我們，腦梗死后高壓氧治療要及早進(jìn)行，從24h即開始干預(yù)可最大限度降低梗死面積，其機(jī)制在于此時(shí)梗死灶尚未開始軟化，瀕臨壞死的神經(jīng)元能夠得到挽救，從而減少半暗帶面積，限制腦梗死進(jìn)一步發(fā)展。這可能與高壓氧能夠改善腦部缺氧、維持血腦屏障完整性、減少細(xì)胞凋亡和增加神經(jīng)再生有關(guān)［12］。確切治療機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，腦梗死早期開始高壓氧治療能夠顯著提高永久性閉塞腦梗死后大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，減小梗死灶體積，改善預(yù)后。腦梗死后給予高壓氧治療可能通過改善腦部缺氧、維持血腦屏障完整性、減少細(xì)胞凋亡和增加神經(jīng)再生等促進(jìn)腦梗死后的神經(jīng)可塑性。此研究可能為臨床上腦梗死患者盡早高壓氧治療提供理論依據(jù)。

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