經(jīng)鼻給予TGF－β1對匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響

劉益民， 韓遠遠， 張慧敏， 王 玉

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)第三大慢性腦功能障礙疾?。?］，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。諸多因素參與了癲癇發(fā)生、發(fā)展過程，近年來越來越多的實驗和臨床研究表明炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)為癲癇的重要病理機制［1～3］。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是一種多功能的細胞生長因子，參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化和細胞損傷的修復(fù)，并可以抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)［4，5］。癲癇形成的過程中，TGF-β1 可能具有潛在的神經(jīng)保護及抗炎作用。由于內(nèi)源性TGF-β1在腦中含量較低，在癲癇形成的超早期，補充TGF-β1可能發(fā)揮神經(jīng)保護及抑制中樞炎癥反應(yīng)，防治癲癇的作用。本實驗在匹羅卡品誘發(fā)的癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后，采取可以繞過血腦屏障直接進入腦內(nèi)的經(jīng)鼻給藥方式給予TGF-β1，動態(tài)監(jiān)測海馬炎性因子白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達水平及小膠質(zhì)細胞活化物CD11b的改變，探討TGF-β1在癲癇形成過程中對神經(jīng)炎癥的影響及可能的機制。

1 材料和方法

1．1 實驗動物

選用清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠84只(安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，6～8周齡，體重160～240g。實驗動物均在安靜的室溫下飼養(yǎng)1w以適應(yīng)環(huán)境，自由進食飲水，適宜濕度及溫度，自然晝夜節(jié)律光照。

1．2 化學試劑

重組人TGF-β1蛋白購自美國Peprotech公司，鹽酸匹羅卡品購自美國Sigma公司，Elisa試劑盒均購自美國Invitrogen公司，免疫組化用小膠質(zhì)細胞標志物CD11b/integinαM多克隆兔抗及二抗試劑盒購自北京博奧森公司。

1．3 實驗方案、匹羅卡品癲癇模型的建立及分組

實驗一:為檢測TGF-β1能否經(jīng)滴鼻順利進入大腦中樞，動物分為 TGF-β1組和對照組(control組)，每組3只。滴鼻方法:25μg TGF-β1重組人蛋白(Peprotech，USA)溶于 40μl消毒 PBS(pH7．4，0．5μg/μl)中。給藥方法參照 Jiang 等人［6］的方法稍有改變:大鼠用戊巴比妥鈉腹腔麻醉(200mg/kg)，取仰臥位，頭頸背用4×4cm的紗布卷稍墊高以有利于藥物進入后鼻腔，應(yīng)用移液槍經(jīng)鼻滴入TGF-β1(2μl/只)。當一側(cè)鼻孔給藥時，大鼠的另一側(cè)鼻孔被輕輕的堵住。對照組應(yīng)用相同方法滴入等容量的PBS。

實驗二:匹羅卡品動物癲癇模型的建立及分組:大鼠接受單次的匹羅卡品腹腔注射(380mg/kg)，致癇前30min皮下注射了甲基-東莨菪堿1mg/kg以減弱匹羅卡品膽堿能反應(yīng)。大鼠行為學觀察參照Racine［7］六級評價標準:Ⅰ級:出現(xiàn)面部抽搐伴咀嚼動作，偶爾的“濕狗樣動作”;Ⅱ級:出現(xiàn)點頭運動，一側(cè)前肢陣攣、頻繁的“濕狗樣動作”;Ⅲ級:出現(xiàn)雙側(cè)前肢陣攣、流涎、站立;Ⅳ級:全身陣攣，失去平衡跌倒;Ⅴ級;癇性發(fā)作持續(xù)。周期性重復(fù)的Ⅲ級及以上級別、持續(xù)達30min界定為SE發(fā)作。匹羅卡品注射后約20min，所有動物均出現(xiàn)SE發(fā)作。在SE后90min，腹腔注射地西泮10mg/kg后SE逐漸終止。死亡率被統(tǒng)計于癲癇持續(xù)狀態(tài)后6h，24只動物死于癲癇持續(xù)狀態(tài)(死亡率約30%)。此時把動物隨機分為3組:正常對照組(Control組，n=18)、匹羅卡品+PBS滴鼻組(Pilo組，n=18)、匹羅卡品+TGF-β1滴鼻組(TGF組，n=18)3組，各組又隨機分為1d、3d、7d 3 個亞組，每組6 只。

1．4 組織處理

實驗一部分，實驗動物滴鼻后1h，10%水合氯醛麻醉后(350mg/kg，腹腔注射)快速斷頭取腦，完整腦組織被取出后存于液氮罐中備Elisa定量檢測。

實驗二部分，各實驗組動物分別于SE后1d、3d、7d，10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，冰盤內(nèi)沿矢狀線直切成對半，一側(cè)半球的海馬組織被離斷，存于液氮罐中備細胞因子Elisa定量檢測;另一側(cè)半球放入4%甲醛溶液中固定72h，之后組織脫水、石蠟包埋，連續(xù)的海馬冠狀切面進行切片，片厚4μm。

1．5 Elisa定量測定

液氮罐中取出標本，保持低溫條件下，各組標本稱重后按一固定比例生理鹽水稀釋，勻漿后移入離心管，4℃低溫離心20min(3000r/min)，離心后取上清液測定。Elisa法分別檢測實驗一部分的重組蛋白TGF-β1及實驗二部分的細胞因子IL-1β、TNF-α蛋白的檢測，具體方法按說明書進行:配標準品，留空白孔，分組加樣品及標準品，洗板，加生物素化抗體工作液，洗板，加酶結(jié)合物工作液，洗板，加洗滌液，洗板，加顯色液，加終止液等;測量 OD450值(10min內(nèi));通過Curve Expert 1．3分析軟件繪制標準曲線:由標準方程求出 TGF-β1、IL-1β 及 TNF-α蛋白的含量。

1．6 免疫組織化學反應(yīng)

按SP三步法法進行免疫組化染色，切片常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復(fù)后依次加入3%H2O2、10%山羊血清閉液，之后加 CD11b/integinαM 抗體(1∶1000)，于4℃冰箱過夜后，滴加二抗工作液及辣根酶標記物，DAB顯色。陰性對照用PBS代替一抗。

1．7 圖像采集及免疫組化圖像分析

圖像采集在Olympus公司提供的自動聚焦顯微鏡下完成，采用同一曝光度，高倍鏡下隨機抽取每張切片的CA1區(qū)5個不同高倍視野用于攝片及分析，分析使用IPP 6．0圖像分析軟件(Media Cybernetics MD，USA)自動分析每張圖片的平均光密度。

1．8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2．1 滴鼻檢測

實驗一中，TGF-β1組滴鼻后1h處死動物，對腦組織勻漿液進行Elisa定量檢測。結(jié)果顯示TGF-β1組和對照組有明顯差異(n=3，3．24 ±0．31 Vs 0．17±0．04ng/g，P＜0．01)，表明 TGF-β1 滴鼻后 1h，蛋白在腦內(nèi)明顯聚集。

2．2 IL-1β、TNF-α 蛋白檢測結(jié)果

各實驗組 IL-1β、TNF-α蛋白的含量具體見表1、表2。對照組大鼠海馬IL-1β、TNF-α蛋白含量甚微;SE 后 1d、3d、7d，TGF 組較 Pilo 組 IL-1β、TNF-α含量均有減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05或P＜0．01)。通過 Pilo組和 TGF組 IL-1β、TNF-α 蛋白組內(nèi)各時間點比較發(fā)現(xiàn)，隨SE后時間的延長，Pilo組這兩種細胞因子蛋白含量呈先上調(diào)后下降趨勢，3d為高峰，7d含量明顯高于1d含量(P＜0．05或P＜0．01)，TGF組各時間點細胞因子含量變化趨勢與Pilo組相一致。

2．3 CD11b形態(tài)及平均光密度值比較

各組大鼠海馬區(qū)CD11b陽性表達見圖1。對照組大鼠海馬CD11b陽性細胞表達較少，胞體呈圓形或橢圓形，突起較少。Pilo組和TGF組陽性細胞著色較深，部分細胞胞體演變成狹長狀及梭狀，突起增多、增粗，以致癇后7d最為明顯。平均光密度值比較(見表3)，Pilo組隨SE后各時間點的延長，呈快速增加趨(P＜0．01)，TGF組的變化趨勢與Pilo組相一致(P＜0．05或P＜0．01)。TGF組與 Pilo組比較，在1d平均光密度無明顯差異(P＞0．05)，3d有明顯差異(P＜0．05)，7d存在顯著差異(P＜0．01)。

表3 各組大鼠不同時間海馬CD11B表達的平均光密度值(χ ± s，n=6)

圖1 癲癇持續(xù)狀態(tài)后各組大鼠海馬CA1區(qū)CD11b的表達

3 討論

TGF-β1是一種多功能細胞因子，可以通過細胞表面的受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細胞的增殖分化、炎癥反應(yīng)和細胞損傷的修復(fù)等［8］。內(nèi)源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括TGF-β1，由于在體內(nèi)的含量較低，對機體的各種創(chuàng)傷的修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用并不明顯［9］。近年來的研究表明，TGF-β1 對帕金森?。?0］、阿爾茨海默?。?1］、亨廷頓?。?2］、腦缺血［13］等中樞神經(jīng)變性疾病有一定的腦保護作用。并且大量研究表明TGF-β1可以抑制中樞內(nèi)的炎癥反應(yīng)［4，5，14］。外源性 TGF-β1的補充可能具有神經(jīng)保護及抑制中樞炎癥反應(yīng)的作用，為癲癇的防治帶來新的希望，然而TGF-β1作為一種大分子多肽類物質(zhì)，周圍用藥很難通過血腦屏障，用藥途徑制約著包括TGF-β1在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究和應(yīng)用。近年來，大量研究證實滴鼻可以使一些大分子多肽類物質(zhì)或某些藥物繞過血腦屏障快速到達中樞［15，16］。較多實驗證實這條路徑是沿嗅覺和三叉神經(jīng)傳導(dǎo)通路進行傳導(dǎo)［17］。本實驗中，在TGF-β1滴鼻后1h，腦內(nèi)即有很高的聚集，提示鼻腔給藥可使藥物快速到達中樞，這與Ma YP等報道相一致［18］。滴鼻成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病實驗研究和潛在的的臨床治療應(yīng)用策略，有效的使藥物繞過血腦屏障，靶向遞送到腦部，比其他中樞給藥具有較多的優(yōu)勢［15］。

癲癇的發(fā)生、發(fā)展與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)密切關(guān)聯(lián)［1，2］。IL-1β 是急性應(yīng)激反應(yīng)和損傷的重要炎性介質(zhì)之一，腦內(nèi)局部IL-1β增高可加重腦組織的炎癥引起驚厥［19］。IL-1β還可以激活血管內(nèi)皮細胞、中性粒細胞等，增強粘附分子表達，促進其他細胞因子如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等釋放，與TNF-α一起引起各種炎癥反應(yīng)，進而誘發(fā)或加重驚厥。TNF-α是一種經(jīng)典促炎細胞因子，在正常腦組織中表達甚微，當各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦缺血、癲癇等發(fā)生時會出現(xiàn)快速上調(diào)。TNF-α能夠調(diào)整突觸的傳遞，尤其是膠質(zhì)細胞釋放的TNF-α，可以通過調(diào)整神經(jīng)元表面的AMPA受體，加快突觸的傳遞;并且通過與不同受體結(jié)合，調(diào)整與谷氨酸能系統(tǒng)相互作用，影響神經(jīng)興奮性，進而影響癲癇發(fā)生的敏感性［20，21］。本實驗中各時間點，TGF組較Pilo組促炎細胞因子IL-1β、TNF-α的分泌表達減少明顯，不僅提示TGF-β1可能減弱了海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)的強度，更提示TGF-β1可能具有潛在的抗癲癇作用。

包括癲癇在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，區(qū)域性的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化是其重要的病理特征，并且這些細胞是炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的主要來源［1］。在顳葉癲癇手術(shù)切除的海馬組織中就存在活化的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞及相關(guān)的炎性介質(zhì)［22］。腦內(nèi)的膠質(zhì)細胞，尤其是小膠質(zhì)細胞，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要細胞類型，為中樞疾病研究的熱點［8］。在 SE 后 3d和 7d，TGF-β1滴鼻處理組較Pilo組小膠質(zhì)細胞平均光密度值有明顯差異，提示TGF-β1抑制了SE引起的小膠質(zhì)細胞的活化。關(guān)于TGF-β1抑制中樞內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化、減輕腦內(nèi)炎癥的作用，曾見于以前的報道［4，5］。本實驗中，外源性的 TGF-β1抑制了細胞因子 IL-1β、TNF-α蛋白的合成，并抑制了小膠質(zhì)細胞的活化，提示應(yīng)用TGF-β1處理，減弱海馬部位的炎癥應(yīng)答。SE后1～3d為匹羅卡品癲癇模型的急性期，3～7d為癲癇形成期或稱潛伏期［22］。在癲癇形成的關(guān)鍵期內(nèi)海馬區(qū)的炎癥反應(yīng)得到抑制，尤其是促炎細胞因子 IL-1β、TNF-α 的分泌表達減少，提示 TGF-β1處理可能會對癲癇腦損傷具有保護作用。

綜上所述，經(jīng)鼻給予TGF-β1可以減少癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬炎性因子IL-1β、TNF-α的表達，抑制了小膠質(zhì)細胞的活化，減輕海馬內(nèi)的炎癥反應(yīng)，可能具有腦保護及抗癲癇的作用。具體的機制仍有待于進一步研究。

［1］Vezzani A，F(xiàn)rench J，Bartfai T，et al．The role of inflammation in epilepsy［J］．Nature reviews，2011，7(1):31 －40．

［2］Friedman A，Dingledine R．Molecular cascades that mediate the influence of inflammation on epilepsy［J］．Epilepsia，2011，52(Suppl 3):33－39．

［3］Vezzani A，Granata T．Brain inflammation in epilepsy:experimental and clinical evidence［J］．Epilepsia，2005，46(11):1724 －1743．

［4］Makwana M，Jones LL，Cuthill D，et al．Endogenous transforming growth factor beta 1 suppresses inflammation and promotes survival in adult CNS［J］．J Neurosci，2007，27(42):11201 －11213．

［5］Qian L，Wei SJ，Zhang D，et al．Potent anti-inflammatory and neuroprotective effects of TGF-beta1 are mediated through the inhibition of ERK and p47phox-Ser345 phosphorylation and translocation in microglia［J］．J Immunol，2008，181(1):660 －668．

［6］Jiang Y，Wei N，Lu T，et al．Intranasal brain-derived neurotrophic factor protects brain from ischemic insult via modulating local inflammation in rats［J］．Neuroscience，2011，172:398 －405．

［7］Racine RJ．Modification of seizure activity by electrical stimulation．II．Motor seizure［J］．Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32(3):281－294．

［8］李良勇，李家林，王 玉．經(jīng)鼻給予TGFβ1對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用［J］．中風與神經(jīng)疾病雜志，2012，29(2):109－112．

［9］Simonato M，Tongiorgi E，Kokaia M．Angels and demons:neurotrophic factors and epilepsy［J］．Trends Pharmacol Sci，2006，27(12):631－638．

［10］Gonzalez-Aparicio R，F(xiàn)lores JA，F(xiàn)ernandez-Espejo E．Antiparkinsonian trophic action of glial cell line-derived neurotrophic factor and transforming growth factor beta1 is enhanced after co-infusion in rats［J］．Exp Neurol，2010，226(1):136 －147．

［11］Caraci F，Battaglia G，Bruno V，et al．TGF-beta1 Pathway as a new target for neuroprotection in alzheimer’s disease［J］．CNS Neuroscience ＆ Therapeutics，2011，17(4):237 －249．

［12］Battaglia G，Cannella M，Riozzi B，et al．Early defect of transforming growth factor beta1 formation in Huntington’s disease［J］．Journal of Cellular and Molecular Medicine，2011，15(3):555 －571．

［13］Ma M，Ma Y，Yi X，et al．Intranasal delivery of transforming growth factor-beta1 in mice after stroke reduces infarct volume and increases neurogenesis in the subventricular zone［J］．BMC Neurosci 2008，9:117．

［14］Mishra L，Derynck R，Mishra B．Transforming growth factor-beta signaling in stem cells and cancer［J］．Science(New York，NY)，2005，310(5745):68 －71．

［15］Alcala-Barraza SR，Lee MS，Hanson LR，et al．Intranasal delivery of neurotrophic factors BDNF，CNTF，EPO，and NT-4 to the CNS［J］．J Drug Target，2010，18(3):179 －190．

［16］Jiang Y，Wei N，Zhu J，et al．A new approach with less damage:intranasal delivery of tetracycline-inducible replication-defective herpes simplex virus type-1 vector to brain［J］．Neuroscience，2012，201:96－104．

［17］Thorne RG，F(xiàn)rey WH．Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system:pharmacokinetic considerations［J］．Clin Pharmacokinet，2001，40(12):907 －946．

［18］Ma YP，Ma MM，Ge S，et al．Intranasally delivered TGF-beta1 enters brain and regulates gene expressions of its receptors in rats［J］．Brain Res Bull，2007，74(4):271 －277．

［19］Vezzani A，F(xiàn)rench J，Bartfai T．The role of inflammation in epilepsy［J］．Nat Rev Neurol，2011，7(1):31 － 40．

［20］Balosso S，Ravizza T，Pierucci M，et al．Molecular and functional interactions between tumor necrosis factor-alpha receptors and the glutamatergic system in the mouse hippocampus:implications for seizure susceptibility［J］．Neuroscience，2009，161(1):293 －300．

［21］Stellwagen D，Beattie EC，Seo JY．Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha［J］．J Neurosci，2005，25(12):3219 －3228．

［22］Ravizza T，Gagliardi B，Noe F，et al．Innate and adaptive immunity during epileptogenesis and spontaneous seizures:evidence from experimental models and human temporal lobe epilepsy［J］．Neurobiol Dis，2008，29(1):142 －160．