杏仁核點燃癲癇大鼠模型海馬組織突觸囊泡蛋白2A的表達(dá)變化

毛詩賢， 馮亞梅， 楚 蘭， 郭文潔， 李 潔

突觸泡蛋白2(synaptic vesicle protein 2，SV2)是屬于跨膜糖蛋白的一種，發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞及內(nèi)分泌細(xì)胞的突觸小泡中，是維持神經(jīng)遞質(zhì)正常分泌水平的調(diào)節(jié)蛋白家族，是突觸傳遞的正向調(diào)節(jié)蛋白［1］。在哺乳動物來說，這種蛋白由3種不同的基因(SV2A、SV2B、SV2C)編碼，SV2A 是其中表達(dá)最廣泛的產(chǎn)物，幾乎在所有的神經(jīng)元中廣泛表達(dá)［2］。Crowder等［1］的研究顯示選擇性敲除SV2A的小鼠可能導(dǎo)致海馬CA3區(qū)的抑制性遞質(zhì)GABA的釋放減少而導(dǎo)致癲癇發(fā)作。這些研究表明SV2A與癲癇關(guān)系密切，但其在癲癇發(fā)生和發(fā)展中的具體機制目前不清。本文就杏仁核點燃癲癇大鼠的模型探討在不同時間段及使用LEV治療后SV2A的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組 清潔級Wistar健康雄性大鼠85只，為貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心提供，體重210～260g。分隔喂養(yǎng)，隨機抽取5只大鼠作為假手術(shù)對照組(D組)，只安裝電極而不刺激。剩余80只大鼠隨機分為癲癇組和模型組，每組根據(jù)實驗需求分批進行，根據(jù)成功點燃后不同時期及胃內(nèi)灌注LEV不同時間段每組又分為1w組、2w組、4w組、8w組4個亞組(模型組 S1、S2、S4、S8，藥物治療組 Y1、Y2、Y4、Y8)，每個亞組5×2只，其中每個亞組取5只做熒光定量PCR、5只做免疫組織化學(xué)分析。

1．2 實驗器材 BL-420型生物多媒體計算機刺激記錄系統(tǒng)(四川泰盟計算機公司生產(chǎn))，大鼠腦立體定位儀，電控箱。

1．3 杏仁核點燃癲癇鼠模型組及治療組模型的制作 大鼠經(jīng)4%水合氯醛(10ml/Kg)腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨及前囟，根據(jù)George Paxinos等大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠右側(cè)杏仁基底外側(cè)核(前囟后2．0mm，矢狀縫旁開5．0mm，電極深度8．5mm，門齒高于耳桿平面3．0mm)，在其顱骨表面投射點鉆孔，并固定雙極螺旋鎳鉻電極，術(shù)后腹腔連續(xù)3d注射青霉素鈉預(yù)防感染，術(shù)后恢復(fù)1w開始點燃實驗。用BL-420型生物多媒體計算機刺激記錄系統(tǒng)刺激杏仁核，每日刺激1次，(刺激參數(shù)為:細(xì)電流、串刺激、波寬1ms，頻率:60Hz，持續(xù)時間 1s，強度 0．450mA)，同時每次電刺激停止后立即觀察大鼠癇性行為。按Racine方法進行分級［2］，完全點燃的標(biāo)準(zhǔn)是連續(xù)3次獲得Ⅳ-Ⅴ級的運動驚厥［3］，之后不再給予上述刺激。

確定慢性點燃模型成功建立后，取大鼠稱重并記錄，按100mg/(Kg．d)計算LEV灌注量，灌胃給藥，2次/d，分別連續(xù)給藥1w、2w、4w、8w，即為藥物治療組Y(Y1、Y2、Y4、Y8)，并觀察給藥后的發(fā)作強度。

1．4 實驗方法

1．4．1 熒光定量 PCR(RealTime-PCR) 標(biāo)本的準(zhǔn)備:將各組大鼠用10%水合氯醛麻醉，斷頭，剪開皮膚，從椎管縱向剪開顱骨，用組織鉗緩慢咬合并逐漸取出表面顱骨，暴露雙側(cè)大腦半球，在其底部可見新月形的海馬組織，用眼科鑷輕輕取出置于錫紙上，并放入－80℃冰箱以留后用。

實驗步驟:將所試驗的標(biāo)本按序排放在管架，依次將各組組織轉(zhuǎn)移至5ml玻璃試管中(100mg，米粒大小)，依次每一管中加入1ml Trizol(預(yù)冷)，電動勻漿器(轉(zhuǎn)速8000r/min)處理30～45s。每標(biāo)本間處理后用酒精(75%乙醇的配置:1倍的DEPC處理水加3倍的無水乙醇)棉球擦拭，DEPC處理水清洗。依次將勻漿液轉(zhuǎn)至1．5mlEppendorf管中，各管中加入氯仿 200μl，振蕩搖勻 15s。4℃，12000r/min，離心15min。小心吸出水層加入依次編號的Eppendorf管中，再加入二倍體積的異丙醇(約600μl)，混勻，置于 －20℃冰箱，30min，4℃，10000r/min，離心 15min，棄上清留沉淀。用650μl 75%乙醇洗滌沉淀，4℃，8000r/min，離心5min，棄上清留沉淀，重復(fù)(6)步驟兩遍，充分吸盡殘留液．打開管蓋，干式恒溫器65℃，5 ～10min，烘干。20μl DEPC 處理水，溶解RNA，－20℃冰箱，保存，待用。

1．4．2 病理學(xué)觀察組織 標(biāo)本的準(zhǔn)備:利用10%的水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后，固定在手術(shù)臺上，腹部朝上，四肢及門齒分開固定，依次切開皮膚、皮下組織、肋骨，打開胸腔，暴露心臟、肝臟，取灌注針自心尖向右上45°進針至主動脈起始端，剪破右心耳，快速灌注生理鹽水100～200ml后，接著以4%多聚甲醛200ml灌注，至大鼠四肢強直、肝臟變白后停止灌注，拔出穿刺針。推入多聚甲醛期間可以見到大鼠四肢、頭部的抽動及全身肌肉抽搐。斷頭取腦后將其置于4%的多聚甲醛(4℃)中固定1～2d，之后行常規(guī)石蠟包埋備用。

免疫組織化學(xué)染色(PV二步法):采用SABC法(SABC法免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程公司)行免疫組化染色，經(jīng)過貼片、晾干、透明、封片，最后光鏡下觀察。應(yīng)用Biomias2001圖像分析系統(tǒng)對海馬CA3區(qū)進行圖像分析，所有切片分析在同一強度、同一放大倍數(shù)下進行。得出每個視野陽性神經(jīng)元的光密度值。

1．5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，各組間采用配對t檢驗法，各亞組間計量資料的分析采用One-way ANOVA方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用LSD法，檢驗水準(zhǔn)為α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 熒光定量PCR結(jié)果(SV2A在癲癇組、治療組及對照組的表達(dá)) 經(jīng)熒光定量PCR檢測溶解、擴增曲線見圖1，SV2A在癲癇1w及治療1w時表達(dá)明顯降低，與對照組比較有明顯差異(P＜0．05);之后表達(dá)逐漸升高;SV2A在癲癇8w組及治療8w組均表達(dá)明顯升高，達(dá)高峰，與對照組比較有明顯差異(P＜0．05);相應(yīng)時間段內(nèi)的對照比較可知，癲癇1w組與治療1w組表達(dá)比較無明顯差異(P＞0．05)，治療組從2w開始，SV2A表達(dá)逐漸增高，用藥前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但治療2w組與對照組比較無明顯差異，4w則明顯增高;見表1、圖1(其中ΔCT為內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值，ΔΔCT為用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值，2－ΔΔCT為表達(dá)量的比值)。

2．2 病理切片結(jié)果(SV2A免疫組化染色)SV2A陽性表達(dá)為神經(jīng)元胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，在海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)呈明顯的板層樣分布?？梢姲d癇組在1w時CA3區(qū)陽性細(xì)胞表達(dá)減少，之后逐漸增多，2w時表達(dá)雖增多，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，到8w的時候表達(dá)陽性細(xì)胞達(dá)高峰，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。而治療組1w時陽性細(xì)胞明顯減少，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，2w開始增多，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05);4w～8w時較對照組增多明顯;癲癇組及治療組內(nèi)部亞組兩兩配對比較，1w組與8w組存在統(tǒng)計學(xué)差異;同時進行相應(yīng)時間段內(nèi)癲癇組與治療組陽性細(xì)胞量的配對比較，除1w組外，2w、4w、8w組用藥前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．05)(見表2、圖2 ～圖5)。

表1 SV2A在癲癇組、治療組及對照組的表達(dá)比較(±s)

表1 SV2A在癲癇組、治療組及對照組的表達(dá)比較(±s)

與對照組比較*P＜0．05，與相應(yīng)時間段比較#P＜0．05，亞組內(nèi)部比較△P ＜0．05

組別 n △Ct -△△Ct 2－△△Ct 0．219 ±0．033＊△0．346 ±0．028#0．370 ±0．031#0．649 ±0．036*#△0．249 ±0．044 0．409 ±0．027#0．519 ±0．037#0．735 ±0．035*#0．402 ±0．035 S1 S2 S4 S8 Y1 Y2 Y4 Y8 D 555555555 7．032 ±0．178 6．406 ±0．132 6．618 ±0．419 5．441 ±0．061 6．693 ±0．194 5．981 ±0．139 5．286 ±0．103 5．151 ±0．118 6．188 ±0．182 2．035 ±0．216 1．845 ±0．046 1．656 ±0．042 0．654 ±0．048 1．935 ±0．081 1．484 ±0．017 1．186 ±0．110 0．556 ±0．035 1．527 ±0．136

表2 癲癇組、治療組、對照組海馬SV2A免疫染色平均光密度值(±s)

表2 癲癇組、治療組、對照組海馬SV2A免疫染色平均光密度值(±s)

與對照組比較*P＜0．05，與相應(yīng)時間段比較#P＜0．05，亞組內(nèi)部比較△P ＜0．05

組別 n 平均光密度值170．966 ±2．196 S1 S2 S4 S8 Y1 Y2 Y4 Y8 D 555555555 194．851 ±3．173△173．809 ±3．881#171．388 ±2．889#156．991 ±4．914*#△189．430 ±2．644*169．097 ±2．583#159．408 ±2．933*#148．916 ±2．476*#

圖1 SV2A(m RNA)基因PCR擴增動力學(xué)曲線、熔解曲線

圖2 癲癇組1w時棕黃色顆粒陽性細(xì)胞表達(dá)減少

圖3 癲癇組8w時陽性細(xì)胞表達(dá)增多

圖4 治療組8w的時候表達(dá)棕黃色顆粒細(xì)胞明顯增多

圖5 假手術(shù)對照組

3 討論

突觸泡蛋白2(synaptic vesicle protein 2，SV2)是一類跨膜糖蛋白，存在于所有突觸泡和內(nèi)分泌泡中，是一個小基因家族，有3種亞型SV2A、SV2B、SV2C，其中SV2A分布最廣泛，在大腦皮質(zhì)廣泛分布，幾乎存在于各種神經(jīng)元中，與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸泡穩(wěn)態(tài)的維持、內(nèi)分泌泡胞吐作用及神經(jīng)肌肉接頭的形成的定位密切相關(guān)。SV2A可作為突觸泡標(biāo)記蛋白，分布一般都伴隨突觸泡的分布［3］。神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)系由神經(jīng)遞質(zhì)的釋放介導(dǎo)，而神經(jīng)遞質(zhì)的釋放依賴于突觸泡循環(huán)。SV2就屬于維持神經(jīng)遞質(zhì)正常分泌水平的調(diào)節(jié)蛋白家族，本實驗即將杏仁核點燃癲癇大鼠及使用左乙拉西坦之后的SV2A的變化進行詳細(xì)描述。

此外，SV2還是抗癲癇藥物的作用靶標(biāo)。左乙拉西坦(levetiracetam LEV)是一種新型抗癲癇藥物(AEDs)，在癲癇發(fā)作的動物模型中有特異的活性譜。LEV對杏仁核電刺激引起的大鼠部分性和繼發(fā)性全身性癲癇發(fā)作表現(xiàn)出強大的抗驚厥作用，可延遲戊四唑驚厥實驗誘發(fā)的點燃發(fā)作，而且間斷給予LEV仍可導(dǎo)致驚厥電活動的降低，提示LEV既可抗急性驚厥，也有長期抗癲癇發(fā)生的作用［4］。在大鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)了左乙拉西坦的可飽和的和立體選擇性的神經(jīng)元結(jié)合位點，其作用靶點是中樞神經(jīng)的突觸囊泡蛋白 SV2A［5～7］，LEV 通過調(diào)節(jié) SV2A 的功能發(fā)揮作用，為以突觸泡蛋白特別是SV2作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物作用靶標(biāo)的研究奠定了基礎(chǔ)。但其是否通過調(diào)節(jié)SV2A而發(fā)揮抗癲癇作用尚未得到證實。在杏仁核點燃模型中SV2A作為調(diào)節(jié)因子表達(dá)水平也升高，給予LEV處理抑制了點燃引起的SV2A升高［6］。以上研究表明 SV2A、LEV及慢性癲癇三者的聯(lián)系，SV2A可能是慢性癲癇的發(fā)病機制之一，具體分子機制仍需我們進一步的研究。

由實驗結(jié)果可知癲癇點燃1w組中出現(xiàn)SV2A的表達(dá)量明顯降低，表明在重復(fù)電刺激過程中，可能產(chǎn)生了對海馬突觸前膜囊泡數(shù)量及功能的損害。癲癇1w并LEV治療1w表達(dá)明顯也降低，可說明LEV在癲癇持續(xù)發(fā)作早期并未對突觸囊泡產(chǎn)生良好的修復(fù)作用;在癲癇發(fā)作2w、4w時存在SV2A表達(dá)量輕微升高，但與對照組比較無明顯差異性，至點燃8w后SV2A表達(dá)量大幅度增加，提示此時經(jīng)過癲癇持續(xù)狀態(tài)的維持和加重，癲癇早期對突觸間正常傳遞活動的破壞及突觸囊泡轉(zhuǎn)化為釋放囊泡過程的影響，可能為慢性期苔蘚纖維出芽及其伴隨的突觸重建奠定了功能和結(jié)構(gòu)上的基礎(chǔ)，形成了新的軸突側(cè)支及新突觸，由此導(dǎo)致突觸泡的分布區(qū)域增加，SV2A表達(dá)增加;在LEV灌胃治療過程中，治療2w后SV2A表達(dá)量開始出現(xiàn)較治療1w組明顯的增加，但與對照組無明顯差異，治療4w時表達(dá)量較對照組已有明顯增加，8w組達(dá)到一個表達(dá)量的高峰期，且除1w組外，2w、4w、8w組均在治療前后的表達(dá)存在明顯差異，據(jù)此說明LEV在使用2w左右才能與SV2A結(jié)合并促進其表達(dá)，隨著治療時間的遞增，SV2A表達(dá)量逐漸增高，表明LEV刺激SV2A參與囊泡轉(zhuǎn)為可釋放囊泡的成熟過程，從而對囊泡膜與細(xì)胞膜的融合過程產(chǎn)生影響，并由此影響遞質(zhì)的釋放，并達(dá)到對癲癇的治療效果。

4 結(jié)論

癲癇組在1w時CA3陽性細(xì)胞表達(dá)減少，到8w的時候表達(dá)陽性細(xì)胞已明顯增多。而治療組1w時陽性細(xì)胞明顯減少，4w～8w時較對照組增多明顯;同時進行相應(yīng)時間段內(nèi)癲癇組與治療組陽性細(xì)胞量的配對比較，可知除1w組外，2w、4w、8w組用藥前后比較有統(tǒng)計學(xué)差異;左乙拉西坦通過與SV2A的結(jié)合影響遞質(zhì)的釋放并治療癲癇。

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