香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的保護(hù)及作用機(jī)制

詹海濤， 吳劍峰， 李海燕， 孟紅旗， 曾煦欣

超早期溶栓是治療急性腦梗死的有效方法，但缺血再灌注引起的繼發(fā)改變，使腦組織損傷進(jìn)一步加重。再灌注期間血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞導(dǎo)致的腦水腫，是急性腦梗死常見致死原因。如何在發(fā)作前給予干預(yù)性藥物，使腦組織處于預(yù)適應(yīng)狀態(tài)，產(chǎn)生保護(hù)作用，對(duì)于減緩再灌注損傷具有重要意義。本研究應(yīng)用線栓法，建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)局灶性腦缺血再灌注損傷模型，探討香港遠(yuǎn)志黃酮苷預(yù)處理，對(duì)再灌注后BBB的通透性、腦含水量、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo-proteinase-9，MMP-9)、水通道蛋白 4(aquaporin 4，AQP 4)表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 香港遠(yuǎn)志黃酮苷的提取、分離與鑒定 香港遠(yuǎn)志藥材采自廣東，采用硅膠、Sephadex LH-20、半制備高效液相色譜等色譜技術(shù)對(duì)香港遠(yuǎn)志全株的70%甲醇提取物進(jìn)行分離純化，綜合運(yùn)用紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、質(zhì)譜(HRESI-MS、ESI-MS)、核磁共振光譜(1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、NOESY)等波譜學(xué)技術(shù)，鑒定出兩種黃酮苷單體化合物:山柰酚-3-O-葡萄糖苷(PHN-08)和山柰酚-3-O-蕓香糖苷(PHN-11)。

1．2 動(dòng)物分組、給藥及缺血再灌注模型制備體重280～300g雄性SD大鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)120只，隨機(jī)分5組:假手術(shù)組、模型組、PHN-08干預(yù)組、PHN-11干預(yù)組及合方組，每組24只。將PHN-08、PHN-11制備成2種注射液，分別含PHN-08 12mg/ml及PHN-11 16mg/ml，合方為上述2種組分按單組分含量等比混合。術(shù)前1w按4ml/kg/d、生理鹽水稀釋腹腔注射、每天1次給藥，假手術(shù)組、模型組按相同方式給等量生理鹽水。采用線栓法［1］建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，模型組及干預(yù)組腦缺血1h后拔出線栓，分別行再灌注24h和48h，蘇醒后手術(shù)側(cè)出現(xiàn)Horner征和對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙為造模成功，假手術(shù)組僅分離血管。將造模中死亡、出血過多、呼吸困難、術(shù)后2h不蘇醒的大鼠棄之，取大鼠另造模。每組大鼠室溫下自由進(jìn)食、進(jìn)水，分別于再灌注24h和48h測定相關(guān)指標(biāo)。

1．3 相關(guān)指標(biāo)測定 在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)，模型及干預(yù)組大鼠隨機(jī)分2組(每組6只)，一組快速斷頭處死，取缺血側(cè)大腦，冠狀切開，前半部測定腦含水量，后半外側(cè)部測定 BBB通透性，內(nèi)側(cè)部測定 AQP 4mRNA;另一組測定MMP-9。假手術(shù)組大鼠隨機(jī)分2組，術(shù)后按上述設(shè)定時(shí)間點(diǎn)和方法測定相關(guān)指標(biāo)。

1．3．1 BBB 通透性測定 應(yīng)用 Uyama等［1］方法，以滲出血管壁外單位腦組織伊文氏藍(lán)(Evan’s blue，EB)含量評(píng)價(jià)BBB通透性。大鼠處死前1h，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，用2%EB生理鹽水溶液(4ml/kg)經(jīng)股靜脈注入，1h后，用生理鹽水自左心室灌注至右心耳流出清亮液體，斷頭取腦，加入2ml 50%三氯醋酸中勻漿，10000r/min，20min，將上清液與無水乙醇3:1稀釋，用熒光分光光度計(jì)測熒光值。每份樣品EB濃度由外標(biāo)準(zhǔn)法算出，無水乙醇與50%三氯乙酸按3:1制備校零標(biāo)準(zhǔn)品。不同濃度EB標(biāo)準(zhǔn)樣品由校零標(biāo)準(zhǔn)品配置，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，測定每份標(biāo)本EB量與組織質(zhì)量比，算出單位腦組織EB含量(μg/g)。

1．3．2 腦含水量測定 大鼠快速斷頭取腦，測濕重后，置電烤箱(110℃，24h)后，速測干重。腦含水量(%)=(腦濕重－腦干重)/腦濕重×100。

1．3．3 MMP-9測定 水合氯醛麻醉大鼠，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注固定，斷頭取腦，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24h。連續(xù)恒冷冰凍切20μm片。每只大鼠隨機(jī)選2張切片，依次用PBS(pH 7．4)漂洗，0．3%H2O2孵育 15min，5% 小牛血清白蛋白封閉，置1∶200多克隆兔抗鼠MMP-9抗體孵育(4℃、過夜)。用1∶200生物素化羊抗兔IgG孵育2．5h，1∶200ABC 復(fù)合物孵育1h，DAB 呈色，PBS漂洗，脫水封片(陰性對(duì)照分別以正常羊血清、兔抗鼠MMP-9多克隆抗體為一抗和二抗)。切片在10×40倍光鏡下，隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每視野陽性細(xì)胞數(shù)(陽性胞質(zhì)呈棕黃色，陰性呈綠色)，算出MMP-9陽性細(xì)胞均數(shù)。

1．3．4 AQP4 mRNA 測定 大鼠快速斷頭取腦，采用 Trizol和RNA PCR Kit(AMV)試劑盒，RTPCR法測定。電泳結(jié)果由凝膠圖象分析系統(tǒng)定量，AQP4 mRNA的量化表達(dá)，由AQP4與β2actin產(chǎn)物的光密度積分比算出。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0．05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 EB含量測定 模型組及干預(yù)組再灌注24h及48h的EB含量均較假手術(shù)組顯著增多(P＜0．001);干預(yù)組再灌注24h及48h的EB含量均顯著低于模型組(其中:合方組再灌注24hP＜0．01，余P＜0．05)，見表1。

2．2 腦含水量測定 與假手術(shù)組比較，模型組及干預(yù)組再灌注24h及48h的腦含水量均顯著增多(其中:模型組P＜0．001，干預(yù)組P＜0．05);干預(yù)組再灌注24h及48h的腦含水量均顯著低于模型組(其中:合方組再灌注48hP＜0．01，余P＜0．05)，見表1。

2．3 MMP-9陽性細(xì)胞測定 與假手術(shù)組比較，模型組及干預(yù)組再灌注24h及48h的MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增多(P＜0．001)，干預(yù)組再灌注24h及48h的MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)均顯著低于模型組(其中:PHN-08、PHN-11組P＜0．05，合方組P＜0．01)，見表2。

2．4 AQP4 mRNA測定 與假手術(shù)組比較，模型組及干預(yù)組再灌注24h及48h的AQP4 mRNA表達(dá)均顯著增高(P＜0．001)，干預(yù)組再灌注24h及48h的AQP4 mRNA表達(dá)均顯著低于模型組(其中:PHN-11、合方組再灌注24hP＜0．01，余P＜0．05)，見表2。

表1 香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注24h及48h EB含量、腦含水量影響(±s)

表1 香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注24h及48h EB含量、腦含水量影響(±s)

與假手術(shù)組比較*P ＜0．05，#P ＜0．001;與模型組比較△P ＜0．05;▲P ＜0．01

EB含量(μg/g)腦含水量(%)組別 例數(shù) 再灌注24h 再灌注48h 再灌注24h 再灌注48h假手術(shù)組模型組PHN-08組PHN-11組合方組6 6 6 6 6 0．58 ±0．13 5．38 ±0．49#4．65 ±0．47#△4．58 ±0．41#△4．25 ±0．39#▲0．54 ±0．12 4．62 ±0．46#4．05 ±0．36#△3．97 ±0．29#△3．94 ±0．27#△78．25 ±2．47 85．97 ±3．03#81．46 ±2．52＊△81．40 ±2．28＊△81．29 ±2．20＊△78．31 ±2．39 87．91 ±3．16#83．18 ±2．91＊△82．92 ±2．64＊△81．37 ±2．18＊▲

表2 香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注24h及48h MMP-9陽性細(xì)胞、AQP4 mRNA影響(±s)

表2 香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注24h及48h MMP-9陽性細(xì)胞、AQP4 mRNA影響(±s)

與假手術(shù)組比較#P ＜0．001;與模型組比較△P＜0．05，▲P ＜0．01

MMP－9 AQP4 mRNA(AQP4/β-actin)組別 例數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)再灌注24h 再灌注48h 再灌注24h 再灌注48h假手術(shù)組模型組PHN-08組PHN-11組合方組6 6 6 6 6 3．71 ±0．58 13．18 ±2．16#10．35 ±1．84#△10．07 ±1．79#△9．71 ±1．63#▲3．68 ±0．53 20．91 ±2．83#17．25 ± 2．39#△17．09 ± 2．14#△16．10 ± 2．20#▲0．82 ±0．03 1．20 ±0．08#1．09 ±0．05#△1．07 ±0．05#▲1．04 ±0．04#▲0．80 ±0．02 1．34 ±0．17#1．14 ±0．13#△1．12 ±0．14#△1．09 ±0．13#△

3 討論

超早期溶栓治療缺血性卒中，快速恢復(fù)局部血供，是急性期治療的關(guān)鍵，但再灌注損傷易形成腦水腫，導(dǎo)致死亡率和致殘率增高。Fisher等［2］認(rèn)為通過預(yù)防性使用某些藥物可減輕再灌注損傷程度，達(dá)到預(yù)防性腦保護(hù)(prophylactic neuroprotection)作用。但開發(fā)療效確切、不良反應(yīng)小、應(yīng)用方便的預(yù)適應(yīng)藥物，仍需大量深入的藥物篩選、藥效和作用機(jī)制研究，在此領(lǐng)域，植物藥具有獨(dú)特的開發(fā)應(yīng)用前景。遠(yuǎn)志屬的多種植物在文獻(xiàn)古籍中具有安神益智作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有提高學(xué)習(xí)記憶力、腦保護(hù)和抗癡呆作用。香港遠(yuǎn)志(Polygala hongkongensis)系遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)遠(yuǎn)志屬植物，在民間以全草入藥，具有活血、化瘀、解毒之功效［3］。本研究首次選用香港遠(yuǎn)志，觀察其黃酮苷單體化合物PHN-08、PHN-11，對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注24h及48h的BBB通透性、腦含水量、MMP-9及AQP4 mRNA表達(dá)的影響，探究其藥理性預(yù)適應(yīng)對(duì)BBB的保護(hù)與作用機(jī)制。

正常的BBB可防止大分子物質(zhì)擴(kuò)散入腦實(shí)質(zhì)，維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，腦缺血再灌注導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能損傷，是腦水腫形成的主要原因。因此，保護(hù)BBB是防治或減輕缺血性腦水腫的關(guān)鍵。研究證實(shí)［4，5］，BBB 的通透性改變與再灌注時(shí)間密切相關(guān)，再灌注3h腦組織的EB滲出量開始增加，提示BBB受損，通透性開始增加，再灌注6～12h，BBB通透性逐漸增加，再灌注24h，通透性增加達(dá)到高峰。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及干預(yù)組再灌注24h及48h的腦皮質(zhì)EB含量和腦含水量均顯著增加，再灌注24h的EB含量增高最顯著，而腦含水量的增加于再灌注48h最顯著，提示，腦缺血再灌注24h已導(dǎo)致BBB通透性增加達(dá)到高峰，至再灌注48h形成嚴(yán)重的腦水腫。與模型組比較，PHN-08、PHN-11及合方組再灌注24h及48h，腦皮質(zhì)EB含量和腦含水量均顯著降低，特別是再灌注24h及48h，在BBB通透性及腦含水量增加的高峰期，合方組的效果更顯著，表明香港遠(yuǎn)志黃酮苷預(yù)處理，可顯著改善局灶性腦缺血再灌注大鼠BBB的通透性，有效減輕繼發(fā)性腦水腫，從而顯示出對(duì)BBB的保護(hù)作用。

腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及諸多病理過程，此過程中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的高表達(dá)受到關(guān)注，尤以MMP-9活性表達(dá)最為顯著。MMP激活后可水解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，使BBB受損，通透性增高，導(dǎo)致血管源性腦水腫［6］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)［4］，MMP-9的表達(dá)在腦缺血再灌注3h開始增加，此后12h、1d、2d、4d 和7d 的表達(dá)均顯著增加，其中2d為高峰期，與腦皮質(zhì)以EB含量為標(biāo)志的BBB開放時(shí)間相關(guān)，證實(shí)BBB的損傷和MMP-9活性增高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及干預(yù)組再灌注24h及48h的MMP-9表達(dá)均顯著增加。與模型組比較，再灌注 24h及 48h，PHN-08、PHN-11及合方組的MMP-9表達(dá)均顯著降低，合方組效果更顯著，這提示，香港遠(yuǎn)志黃酮苷降低BBB通透性、減輕繼發(fā)性腦水腫的作用機(jī)制，與抑制MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

水通道蛋白(apuaporins，AQPs)是一組廣泛存在于各種生物細(xì)胞膜的通道蛋白，主要介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)以AQP4分布最廣，尤與毛細(xì)血管和軟腦膜接觸的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)最顯著，是膠質(zhì)細(xì)胞在腦脊液與血管間介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道蛋白。研究證實(shí)［7］AQP4的高表達(dá)與缺血誘導(dǎo)的腦水腫密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究也證實(shí)［8］，AQP4阻斷劑可緩解腦水腫的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及干預(yù)組再灌注24h及48h的AQP4表達(dá)均顯著增加。與模型組比較，再灌注24h及48h，PHN-08、PHN-11及合方組的MMP-9表達(dá)均顯著降低，PHN-11及合方組再灌注24h效果更顯著，這提示，香港遠(yuǎn)志黃酮苷通過抑制AQP4的表達(dá)，保護(hù)BBB的完整性、緩解繼發(fā)性腦水腫。

本研究結(jié)果表明，香港遠(yuǎn)志黃酮苷預(yù)處理，在多時(shí)段、多靶點(diǎn)對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠BBB具備保護(hù)作用，作用機(jī)制可能是抑制MMP-9和AQP4的表達(dá)，改善BBB通透性，緩解繼發(fā)性腦水腫，從而顯示出有效的藥理性預(yù)適應(yīng)效能。本研究香港遠(yuǎn)志黃酮苷單一組分與組分配伍間的效果差異，或許因組分配伍后造成藥物特征或藥物作用環(huán)境改變而致。新近的體外和在體研究證實(shí)［9～11］，香港遠(yuǎn)志有效成分具有抗氧化作用，因此，香港遠(yuǎn)志黃酮苷改善BBB通透性的更為明確作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究抑制MMP-9、AQP4的表達(dá)與抗氧化間的因果關(guān)系，療效的時(shí)序性以及是否影響其他遞質(zhì)或分子。

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