黑曲霉對菲共代謝降解的影響

侯雪敏， 臧淑艷， 李盼盼， 王 娟， 秦曉龍， 林 樂

(沈陽化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽110142)

多環(huán)芳烴是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物，其主要來源為礦物燃料不完全燃燒及火山活動等，也是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的化學(xué)致癌物.菲是典型的多環(huán)芳烴類有機(jī)污染物之一，具有毒性大和降解性較差等特點(diǎn).含菲廢水主要來源于酸性礦山廢水，而酸性礦山廢水主要來自于礦井水、選煤廢水、焦化廠廢水等.這些礦山廢水排放量大，持續(xù)性強(qiáng)，排放地點(diǎn)分布廣泛，不易控制與處理，對環(huán)境的污染十分嚴(yán)重.因此，處理廢水中的菲成為當(dāng)今的熱點(diǎn)問題，有研究報道［1－2］國內(nèi)某些重要水域已受到不同程度的污染.

針對難降解的高濃度有機(jī)污染物的工業(yè)廢水，必須采取科學(xué)和先進(jìn)的技術(shù)方法進(jìn)行處理.這些處理技術(shù)主要有物理法、化學(xué)法和微生物法［3］.微生物法是國內(nèi)外處理酸性廢水的最新方法，這種方法有成本低、適用性強(qiáng)、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［4－8］.而針對傳統(tǒng)方法所確定的微生物難降解物質(zhì)有必要將共代謝作用考慮在內(nèi).共代謝過程提出了一種新的代謝現(xiàn)象，而且降解主要是真菌、細(xì)菌等.魏明寶［9］等人以蒽為代表研究了環(huán)境微生物對其降解過程.祝儒剛［10］等人對分離的菌株進(jìn)行了培養(yǎng)條件的優(yōu)化和對不同濃度菲降解率的測定.許麗［11］等人研究了細(xì)菌對多環(huán)芳烴的降解能力.胡順利［12］等人研究了降解菲方面生物的可利用性.文獻(xiàn)［13－15］在不同情況下研究了共代謝對微生物降解速率的影響.本實(shí)驗(yàn)將微生物降解作用與共代謝作用相結(jié)合，利用真菌黑曲霉降解模擬廢水中的多環(huán)芳烴菲，對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探討.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及材料

1.1.1 主要儀器

FT-IR470型紅外光譜儀，美國Nicolet公司; HZQ-C雙層氣浴振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司;YXQ-LS-18SI型自動手提式滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-1D(1G)型單人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司等.

1.1.2 主要試劑

菲、丙酮，分析純，天津市北方化工購銷中心;二氯甲烷，分析純，沈陽市億泰貿(mào)易有限公司;水楊酸、鄰苯二甲酸，分析純，沈陽萊博貿(mào)易有限公司;琥珀酸鈉，分析純，沈陽國藥化學(xué)試劑有限公司;乙酸乙酯，分析純，康科德科技有限公司;蔗糖，分析純，哈爾濱市化工試劑廠等.

1.1.3 菌種來源

實(shí)驗(yàn)選用的真菌黑曲霉來自中國科學(xué)院生態(tài)研究所.

1.1.4 培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，去皮，切成小塊，加蒸餾水1 000 mL，煮沸30 min，過濾，濾液定容到1 000 mL，加蔗糖20 g.

無機(jī)鹽培養(yǎng)基:NH4NO3，1 g;MgSO4·7H2O，0.2 g;CaCl2·2H2O，0.01 g;FeSO4·7H2O，0.01 g;KH2PO4，0.4 g;Na2HPO4·12H2O，0.6 g;葡萄糖，0.5 g;蒸餾水1 L.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菲含量的測定方法

分別配置體積分?jǐn)?shù)為0、0.5×10－6、1× 10－6、1.5×10－6、2×10－6、2.5×10－6、3×10－6、4×10－6、5×10－6、8×10－6的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用紫外分光光度計(jì)測量樣品Abs，根據(jù)Lambert-Beer定律:A=εbc，光譜帶寬1 nm，取樣間隔1 nm，在253 nm處記錄吸光度，保存數(shù)據(jù)，繪制曲線.

1.2.2 真菌黑曲霉生長曲線

將配置好的馬鈴薯培養(yǎng)基精確分裝于16個250 mL錐形瓶中，每瓶50 mL，在無菌室將培養(yǎng)24 h的黑曲霉菌接到錐形瓶中，在搖床中培養(yǎng)5 d.用電子天平對烘干后的每張稱量紙進(jìn)行稱質(zhì)量，每6 h取2個平行樣進(jìn)行過濾、烘干、稱質(zhì)量，計(jì)算每6 h黑曲霉質(zhì)量凈增情況，繪制出黑曲霉生長曲線.

1.2.3 菲初始體積分?jǐn)?shù)對降解的影響

配置體積分?jǐn)?shù)為20×10－6、60×10－6、100× 10－6、140×10－6、180×10－6菲的溶液，然后每個錐形瓶接入體積分?jǐn)?shù)10%黑曲霉，用紗布封好口放入搖床，培養(yǎng)5 d.過濾，用二氯甲烷萃取，定容.每份3個平行樣，使用紫外分光光度計(jì)測量樣品在253 nm處的吸光度，計(jì)算菲降解率.

1.2.4 不同共代謝底物對菲降解的影響

先按無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方配制1 000 mL培養(yǎng)基，精確分裝5份于250 mL錐形瓶中，每份200 mL，之后分別稱取水楊酸、琥珀酸鈉、磷苯二鉀酸、萘，使其與菲的體積比為1∶5，配制體積分?jǐn)?shù)100×10－6菲溶液，然后每個錐形瓶接入體積分?jǐn)?shù)10%上述培養(yǎng)的黑曲霉，每份3個平行樣，用紗布封好口放入搖床，培養(yǎng)5 d.過濾，用二氯甲烷萃取，定容.使用紫外分光光度計(jì)測量樣品吸光度，計(jì)算菲降解率.

1.2.5 菲與共代謝底物的最佳濃度比

先按無機(jī)鹽培養(yǎng)配方配制1 000 mL培養(yǎng)基，精確分裝5份于250 mL錐形瓶中，分別配置體積分?jǐn)?shù)為0、20×10－6、60×10－6、100×10－6、140×10－6珀酸鈉溶液，每個錐形瓶放入0.020 0 g菲(即體積分?jǐn)?shù)100×10－6菲溶液)，然后每個錐形瓶接入體積分?jǐn)?shù)10%、培養(yǎng)24 h的黑曲霉，每份3個平行樣，入搖床.培養(yǎng)5 d.過濾，用二氯甲烷萃取，定容.使用紫外分光光度計(jì)測量樣品吸光度，計(jì)算菲降解率.

1.2.6 酸度對菲共代謝降解的影響

將1 000 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基精確分4份裝于250 mL錐形瓶中，配制出體積分?jǐn)?shù)100×10－6菲溶液及琥珀酸鈉溶液，調(diào)節(jié)每個錐形瓶pH值，使4瓶pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0，然后每個錐形瓶接入體積分?jǐn)?shù)為10%的黑曲霉，每份3個平行樣，用紗布封好口放入搖床.設(shè)定搖床溫度28℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)5 d.過濾，用二氯甲烷萃取、定容.測樣:使用紫外分光光度計(jì)測量樣品吸光度，計(jì)算菲降解率.

2 結(jié)果與討論

2.1 菲檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知:線性方程為 y=0.340 6x+ 0.009 5，其中R2=0.998 8.當(dāng)菲體積分?jǐn)?shù)在0～8×10－6之間時，菲的吸光度呈良好直線形狀，因此，之后測定菲濃度時用此菲的標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度太高則進(jìn)行稀釋，太低則進(jìn)行濃縮.

圖1 菲溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phenanthrene solution

2.2 真菌黑曲霉生長曲線

從圖2可以看出:黑曲霉在前12 h生長緩慢，從12 h到30 h生長極其迅速，成對數(shù)生長期，30 h后黑曲霉長勢基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，因此，黑曲霉最佳生長時間為30 h.

圖2 黑曲霉的生長曲線Fig.2 Growth curve of the aspergillus niger

2.3 菲起始濃度對降解的影響

菲起始濃度對降解的影響如圖3所示.

圖3 菲起始體積分?jǐn)?shù)對降解的影響Fig.3 Effect of initial concentration of phenanthrene on the degradation

由圖3可知:起始濃度對菌株生長的影響較為明顯.在一定范圍內(nèi)，隨著菲起始濃度升高，有利于微生物降解，當(dāng)菲體積分?jǐn)?shù)達(dá)到100×10－6時，菲的降解率達(dá)到最高，但是隨著菲濃度繼續(xù)增大時，降解率隨之降低.這可能是因?yàn)殚_始時未達(dá)到微生物的毒性耐受限度，當(dāng)菲濃度過高的時候，菲毒性增大，達(dá)到微生物耐受限度，導(dǎo)致真菌活性降低，因此，真菌對菲的降解率降低.所以菲溶液的最佳體積分?jǐn)?shù)為100×10－6.以下實(shí)驗(yàn)菲濃度均采用體積分?jǐn)?shù)100×10－6.

2.4 不同共代謝底物對菲降解的影響

對比圖3可以看出:在有共代謝底物的存在下，降解率有明顯提高.由圖4可以看出，共代謝底物對降解率影響:萘＜鄰苯二甲酸＜水楊酸＜琥珀酸鈉，并且可以看出琥珀酸鈉可以最大程度地提高菲的降解率.這可能是因?yàn)橄驈U水中加入代謝中間產(chǎn)物能提高微生物酶的活性，而琥珀酸鈉更好地提高了某些可誘導(dǎo)酶活性，使菲更具有親和力，因此，能被迅速降解，促進(jìn)共代謝降解過程.因此，選擇琥珀酸鈉作為共代謝的一級基質(zhì)較好.

圖4 不同共代謝底物對菲降解率的影響Fig.4 Influence of different metabolic substrate on the degradation of phenanthrene

2.5 菲與共代謝底物的最佳濃度比

圖5可知:隨著琥珀酸鈉濃度升高，菲的降解率隨之升高，當(dāng)琥珀酸鈉體積分?jǐn)?shù)達(dá)到100× 10－6時，菲的降解率達(dá)到最高，在體積分?jǐn)?shù)為140×10－6時下降.這可能是因?yàn)殓晁徕c濃度在一定范圍內(nèi)為黑曲霉提供了良好的碳源，由于琥珀酸鈉和菲有相似的結(jié)構(gòu)，使黑曲霉在降解琥珀酸鈉的同時所分泌的酶很好地降解了菲;但是，當(dāng)琥珀酸鈉體積分?jǐn)?shù)大于100×10－6時，即達(dá)到140×10－6，菲和琥珀酸鈉有競爭關(guān)系，琥珀酸鈉毒性更小，比較容易降解，使菲的降解率有所降低.所以，在實(shí)驗(yàn)中作為共代謝底物的琥珀酸鈉最佳體積分?jǐn)?shù)為100×10－6，以下實(shí)驗(yàn)琥珀酸鈉體積分?jǐn)?shù)均采用100×10－6，即菲與琥珀酸鈉最佳體積分?jǐn)?shù)比為1∶1.

圖5 不同琥珀酸鈉體積分?jǐn)?shù)對菲降解率的影響Fig.5 Influence of different succinic acid sodium concentration on the phenanthrene degradation

2.6 酸度對菲共代謝降解的影響

由圖6可知:在pH值為5.0、8.0時，酸度對菲共代謝降解率變化影響不大，最佳pH范圍是6.0～7.0.其原因可能是微生物更適合于弱酸性，在pH6.0～7.0左右時，微生物酶活性大大提高，使菲的降解率增大;當(dāng)趨于堿性時，微生物酶活性受到抑制，降解率降低.最佳pH范圍在6.0～7.0.

圖6 不同pH值對菲降解率的影響Fig.6 Effect of different pH on the phenanthrene degradation

3 結(jié)論與展望

實(shí)驗(yàn)主要研究了優(yōu)勢真菌黑曲霉對模擬的含菲廢水降解作用，主要結(jié)論如下:

(1)通過黑曲霉生長曲線的實(shí)驗(yàn)可知黑曲霉的最旺盛生長時間為30 h.

(2)通過對菲濃度的選擇，得出黑曲霉降解菲的最佳體積分?jǐn)?shù)為100×10－6.

(3)通過對不同共代謝底物的實(shí)驗(yàn)，得出最佳共代謝底物為琥珀酸鈉.

(4)對不同的一級基質(zhì)與二級基質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)比實(shí)驗(yàn)，得出體積分?jǐn)?shù)比為1∶1時效果較好.

(5)通過進(jìn)行酸度對共代謝影響的實(shí)驗(yàn)，得到pH值在6.0～7.0左右，降解率最高.

由于時間和實(shí)驗(yàn)條件的關(guān)系，諸多新發(fā)現(xiàn)和新設(shè)想還未來得及進(jìn)一步的驗(yàn)證.在今后的實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)把對降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)及毒理性質(zhì)的研究作為重點(diǎn)，從而選擇降解方法和途徑.

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