大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有關(guān)物質(zhì)檢測方法研究進(jìn)展

鄧晶晶，唐克慧

(1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，四川 成都 610083;2.中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610051)

有關(guān)物質(zhì)多指藥物中的有機(jī)雜質(zhì)，也包括殘留溶劑和手性化合物中無特殊毒性的對映體。其主要來源于藥物的制備和貯存過程，如合成過程中的副反應(yīng)產(chǎn)物，原料中的雜質(zhì)，純化和精制操作中帶入的雜質(zhì)，以及因成品貯存條件因素引入的雜質(zhì)等。藥物中含有雜質(zhì)會(huì)降低其療效和影響其穩(wěn)定性，甚至對人體健康有害或產(chǎn)生其他副作用。因此，對有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測，控制藥物純度，以控制藥物質(zhì)量至關(guān)重要。綜合大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有關(guān)物質(zhì)檢查的相關(guān)報(bào)道，主要是根據(jù)吸附或分配性質(zhì)等的差異采用色譜法對雜質(zhì)進(jìn)行測定，如薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC－MS)及氣相色譜法(GC)等，也有的采用毛細(xì)管電泳法(CE)。其中氣相色譜法主要用于殘留有機(jī)溶劑的檢測，在此重點(diǎn)闡述TLC法、HPLC法、LC－MS法及CE法等在該類抗生素有關(guān)物質(zhì)檢測中的應(yīng)用，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 薄層色譜法

TLC法是一種檢測有關(guān)物質(zhì)的經(jīng)典方法，具有快速、簡便、操作簡單等特點(diǎn)，尤其適用于檢測無紫外吸收的物質(zhì)。目前，各國藥典在采用TLC檢測該類抗生素中某一藥物的有關(guān)物質(zhì)時(shí)，均采用了系列對照溶液進(jìn)行梯度點(diǎn)樣的方法來“半定量”地評估雜質(zhì)量，并對雜質(zhì)數(shù)目、最大雜質(zhì)量和總雜質(zhì)量均有詳盡的評判要求。在用TLC檢測有關(guān)物質(zhì)時(shí)，若分離效果達(dá)不到要求，則影響測定的準(zhǔn)確性，故應(yīng)有系統(tǒng)適用性試驗(yàn)檢測系統(tǒng)的有效性。余立等[1]在用TLC檢測阿奇霉素及其有關(guān)物質(zhì)時(shí)，考慮到紅霉素既是阿奇霉素的合成前體，又是其主要降解產(chǎn)物，且易于得到，而斑點(diǎn)又和阿奇霉素相鄰，因此選擇紅霉素作為該色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)指標(biāo)物質(zhì)，并規(guī)定阿奇霉素與紅霉素主斑點(diǎn)要完全分離，以保證色譜系統(tǒng)的有效性。唐克慧等[2]在用TLC檢測克拉霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)時(shí)，對克拉霉素注射液采用乙酸乙酯作為萃取溶劑分多次萃取的方法進(jìn)行前處理，并通過試驗(yàn)證明了該萃取方法的可行性，同時(shí)建立的萃?。由V法較成功地解決了輔料嚴(yán)重干擾克拉霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)檢測這一難題。

2 高效液相色譜法

HPLC法具有分離效率高、選擇性好、分析速度快、操作自動(dòng)化和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)，目前是各類藥物有關(guān)物質(zhì)檢測的主要方法，如雜質(zhì)對照品法(適用于已知雜質(zhì))、主成分自身稀釋對照法(適用于一般雜質(zhì)檢查，雜質(zhì)成分少且尚不能取得其對照品，簡稱“自身對照法”，分為加校正因子計(jì)算和不加校正因子)、歸一化法(現(xiàn)已不多用)，第一法為外標(biāo)法、定量檢測，后兩法均為限量檢測[3]。在對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和利福霉素類抗生素的有關(guān)物質(zhì)檢測中，HPLC應(yīng)用非常廣泛。在已見報(bào)道的方法中，檢測器的選擇又以紫外檢測器為主，如李戰(zhàn)[4]、林玲等[5]、戴玉榮等[6]、楊亞莉等[7]、魏王君等[8]分別采用該方法對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的代表藥物進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)的檢測。而根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，所選擇的紫外檢測器的波長基本都處于低波長位置，但在此位置檢測易產(chǎn)生干擾。因此，除紫外檢測器外，電化學(xué)檢測器在該類抗生素的相關(guān)物質(zhì)檢測中也有應(yīng)用。電化學(xué)檢測器是根據(jù)電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測，在液相色譜中，可以檢出所有電活性物質(zhì)。欒杰等[9]和李海英等[10]均采用電化學(xué)檢測器的高效液相色譜法進(jìn)行阿奇霉素的有關(guān)物質(zhì)檢測，定量檢出了阿奇霉素中紅霉素過氧化物、阿奇霉素脫氧化物、阿奇霉素雜質(zhì)A和N脫甲基阿奇霉素等有關(guān)物質(zhì)。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該法較之該類藥物國內(nèi)通用的微生物檢定法有很大的優(yōu)越性，具有靈敏度高、線性范圍寬、精密度好、專屬性強(qiáng)、易于準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，大大提高了檢測效率和檢測速度。

3 高效液相－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

LC－MS聯(lián)用技術(shù)將高分離性能的LC技術(shù)與能夠獲取豐富化學(xué)結(jié)構(gòu)信息的MS技術(shù)相結(jié)合，可直接對微量未知化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。與以紫外檢測器為檢測手段的HPLC法相比，MS檢測技術(shù)提供了更快速、有效的未知雜質(zhì)鑒定，省去了分離與純化過程，有效節(jié)約了時(shí)間。Govaerts等[11]采用LC－MSn對琥乙紅霉素中的4種未知雜質(zhì)進(jìn)行了鑒定。Debremaeker等[12]利用液相色譜－離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成功分離和鑒定出阿奇霉素樣品中6個(gè)未知的相關(guān)物質(zhì)。因此，充分利用LC－MS技術(shù)獲得的信息可迅速實(shí)現(xiàn)藥物有關(guān)物質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定。

Kumar等[13]在進(jìn)行紅霉素樣品的檢測鑒定過程中，首先利用MS/MS和MSn技術(shù)建立了相關(guān)物質(zhì)譜庫，之后再運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用方法將紅霉素樣品中的相關(guān)物質(zhì)與之前的相關(guān)物質(zhì)譜庫中的結(jié)果進(jìn)行對比，從而鑒定出紅霉素中的8個(gè)未知相關(guān)物質(zhì)。Deubel等[14]將電噴霧離子化多級質(zhì)譜分析方法用于紅霉素A(EA)及其相關(guān)物質(zhì)的測定，利用多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(MRM)成功檢測了紅霉素A及其相關(guān)物質(zhì)，并通過較先進(jìn)的離子阱系統(tǒng)軟件推測得出預(yù)期效果之外的2個(gè)新的相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，該方法的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度均超過要求，且線性關(guān)系良好。Leonard等[15]在檢測克拉霉素及其有關(guān)物質(zhì)時(shí)采用LC－MSn技術(shù)，通過試驗(yàn)對克拉霉素中的1個(gè)未知雜質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，并分離檢測出另外2個(gè)未知雜質(zhì)。Pendela等[16]在檢測螺旋霉素的有關(guān)物質(zhì)時(shí)采用了液質(zhì)聯(lián)用方法，其液質(zhì)條件中利用大氣壓化學(xué)離子化源(ACPI)作為接口技術(shù)，該技術(shù)是一種非常耐用的離子化技術(shù)，通常不需特殊優(yōu)化，容易使用。在該試驗(yàn)條件下，通過對螺旋霉素及其有關(guān)物質(zhì)的碎片離子的分析，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)有關(guān)物質(zhì)，其中3個(gè)為歐洲藥典中已經(jīng)報(bào)道的特定雜質(zhì)。

4 毛細(xì)管電泳技術(shù)

CE也稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE)，是近年發(fā)展起來的一種儀器分析方法，可廣泛應(yīng)用于分離、分析有機(jī)與無機(jī)陰、陽離子，手性分子、中性分子及大分子，以及單細(xì)胞。CE是在毛細(xì)管分離通道中，在電場作用下，帶電質(zhì)點(diǎn)(離子或膠粒)在電解質(zhì)溶液中，向電荷相反的電極遷移。在遷移過程中，因帶電質(zhì)點(diǎn)的電荷數(shù)量、電荷符號與質(zhì)點(diǎn)大小的差別，造成遷移速率的不同而達(dá)到分離。

在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的有關(guān)物質(zhì)檢測中用到了2種毛細(xì)管電泳的分離分析技術(shù)，分別為毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)和毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)。前者是通過在充滿電解質(zhì)溶液的開口毛細(xì)管中，荷質(zhì)比不同的組分在電場作用下，電泳淌度不同而被分離的，荷質(zhì)比大的離子電泳淌度大，先到達(dá)檢測窗口;反之，則后到達(dá)。該方法常作為反相高效液相色譜的補(bǔ)充。Lalloo等[17]通過試驗(yàn)考察，確定了檢測紅霉素中有關(guān)物質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳工作條件為150 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)－35%乙醇，分離電壓30 kV，檢測波長200 nm。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法可準(zhǔn)確用于紅霉素和其相關(guān)物質(zhì)(如紅霉素C等)的分離和定量分析。而MECC則具有電泳和色譜的兩重分離性能。該分析方法是在緩沖液中加入表面活性劑，當(dāng)表面活性劑的濃度超過臨界濃度(CMC)時(shí)，則聚結(jié)而形成膠束，從而在含有膠束的背景電解質(zhì)中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。在MECC系統(tǒng)中，實(shí)際存在著類似于色譜的兩相:一相是流動(dòng)的水相;另一相是起到固定作用的膠束相。樣品在這兩相之間分配，并由于其在膠束中不同的保留能力而產(chǎn)生差速遷移。Tobback[18]等用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定了大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中泰樂菌素及其相關(guān)物質(zhì)。測定條件為，以80 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH=7.5)－20 mmol/L膽酸鈉－7 mmol/L溴化十六烷基三甲銨為背景電解質(zhì)，運(yùn)行電壓18 kV，檢測波長205 nm，在該測定條件下泰樂菌素和其相關(guān)物質(zhì)在15 min內(nèi)能夠得到有效分離。

5 結(jié)語

綜上所述，目前對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有關(guān)物質(zhì)的檢測主要還是采用色譜分析方法，而HPLC法又因分離效能高、應(yīng)用范圍廣，成為主要檢測手段，但HPLC法及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)并不能夠完全替代TLC法。HPLC法多是在反相色譜上對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測，TLC法則是在正相色譜上對被測物進(jìn)行檢測。對于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，因該類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，若選擇HPLC法，其紫外檢測波長均在短波位置，在檢測時(shí)干擾較多，因此在2010年版《中國藥典》中，對該類藥物中的阿奇霉素和琥乙紅霉素有關(guān)物質(zhì)的檢測仍選用TLC法進(jìn)行。利用液相－質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)則可在使用色譜方法對有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分離的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測，更有利于全面掌握有關(guān)物質(zhì)的信息。但必須解決好來自于色譜和質(zhì)譜兩方面的問題，主要包括液相色譜液體流動(dòng)相的去除，質(zhì)譜靈敏度、穩(wěn)定性的提高和質(zhì)譜體積、成本的降低。CE法是目前研究較多的色譜新方法，該法沒有HPLC法中存在的傳質(zhì)阻抗、渦流擴(kuò)散等降低柱效的因素，縱向擴(kuò)散也因毛細(xì)管壁雙電層的存在而受到抑制，因而能達(dá)到很高的理論板數(shù)及極好的分離效果，在經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性等方面顯示了巨大的優(yōu)勢。目前，將CE的高分辨率與質(zhì)譜的高靈敏度相結(jié)合的最新聯(lián)用技術(shù)已得到初步發(fā)展，該儀器具有高柱效、高分辨率、高靈敏度及分析速度快的顯著特點(diǎn)。但由于質(zhì)譜儀接口的限制，在氣相色譜－毛細(xì)管電泳法聯(lián)用時(shí)，只能用含有揮發(fā)性緩沖鹽的背景電解質(zhì)，對氣相色譜法的分離效果有一定限制，因此成為目前此聯(lián)用技術(shù)亟待解決的問題。

[1]余 立，王俊秋，王國蘭，等.薄層色譜法檢測阿奇霉素及其有關(guān)物質(zhì)[J].中國抗生素雜志，2001，26(3):227－229.

[2]唐克慧，常 寧，許重陽，等.萃?。由V法檢測克拉霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)[J].中國抗生素雜志，2003，28(11):663－665.

[3]謝沐風(fēng).如何建立高效液相色譜法測定有關(guān)物質(zhì)的方法[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38(1):45 －48

[4]李 戰(zhàn).HPLC測定鹽酸阿奇霉素及其有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(1):91－92.

[5]林 玲，施潔明.梯度洗脫HPLC測定克拉霉素緩釋片的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥學(xué)雜志，2008，43(18):1 424－1 426.

[6]戴玉榮，成海平，崔文奇，等.HPLC法測定地紅霉素腸溶微丸的有關(guān)物質(zhì)[J].中國新藥雜志，2008，17(14):1 252－1 253.

[7]楊亞莉，王 晨，王明娟，等.國產(chǎn)琥乙紅霉素組分和有關(guān)物質(zhì)的分析[J].中國抗生素雜志 ，2008，33(9):570 －573.

[8]魏 王君，陳國俊.高效液相色譜法測定復(fù)方羅紅霉素片的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥業(yè)，2009，18(5):28 －29.

[9]欒 杰，周國慶，王海霞，等.HPLC電化學(xué)檢測阿奇霉素片的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房，2008，19(25):1 975－1 976.

[10]李海英，陳 悅.高效液相色譜電化學(xué)檢測法在硫酸阿奇霉素含量測定和有關(guān)物質(zhì)概況分析上的應(yīng)用[J].西北藥學(xué)雜志，2003，18(4):147－149.

[11]Govaerts C，Chepkwony HK，Schepdael AV，et al.Investigation of unknown related substances in commercial erythromycin samples with liquid chromatography/mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2000，14(10):878 －884.

[12]Debremaeker D，Visky D，Chepkwony HK，et al.Analysis of unknown compounds in azithromycin bulk samples with liquid chromatography coupled to ion trap mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2003，17(4):342 －350.

[13]Kumar CS，Govaerts C，Adams E，et al.Identification of impurities in erythromycin by liquid chromatography－mass spectrometric detection[J].J Chromatogr A，2004，1 056(1－2):111－120.

[14]Deubel A，F(xiàn)andino AS，Govaerts C，et al.Determination of erythromycin and related substances in commercial samples using liquid chromatography/ion trap mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2006，1 136(1):39 －47.

[15]Leonard S，F(xiàn)erraro M，Adams E，et al.Application of liquid chromatography/ion trap mass spectrometry to the characterization of the related substances of clarithromycin[J].Rapid Communication in Mass Spectrometry，2006，20(20):3 101 －3 110.

[16]Pendela M，Govaerts C，Diana J，et al.Characterization of impurities in spiramycin by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry[J].Rapid Communication in Mass Spectrometry，2007，21(4):599 －613.

[17]Lalloo AK，Kanfer I.Determination of erythromycin and related substances by capillary electrophoresis[J].J Chromatography B，Biomed Sci Appl.1997，704(1－2):343－350.

[18]Tobback K，Li YM，Pizarro NA，et al.Micellar electrokinetic capillary chromatography of macrolide antibiotics[J].J Chromatography A，1999，857(1－2):313－320.