三萜皂苷生物合成途徑研究進(jìn)展

陳 穎，孫海燕，曹銀萍

(河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

三萜皂苷是由三萜皂苷元和糖經(jīng)糖苷鍵連接而成的配糖體，使植物有防御病原體和害蟲侵襲的能力。其在體外具有抗血小板、抗腫瘤、抗病毒、降低膽固醇、消炎及作為免疫佐劑等多種重要的藥用價(jià)值。三萜皂苷主要為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜兩大類，其中達(dá)瑪烷型為四環(huán)三萜的主要類型，齊墩果烷型為五環(huán)三萜的主要類型。研究發(fā)現(xiàn)三萜皂苷廣泛分布在五加科、葫蘆科、傘形科、商陸科、豆科、木犀科、山茶科、桔?？?、遠(yuǎn)志科、七葉樹科等植物中，許多常用中藥如人參、黃芪、柴胡、三七、麥冬、知母、甘草、白頭翁、夏枯草、絞股藍(lán)、牛膝、合歡、天師栗等都含有三萜皂苷。由于三萜皂苷在植物中含量較低，限制了其廣泛應(yīng)用。目前常采用優(yōu)化組織細(xì)胞培養(yǎng)條件，應(yīng)用誘導(dǎo)子及發(fā)根培養(yǎng)體系來提高藥用植物三萜皂苷含量，但這些研究也未能從根本上解決三萜皂苷含量較低的問題。而近年來在紅豆杉、長(zhǎng)春花、罌粟、紫草、青蒿等藥用植物中開展的次生生物基因調(diào)控研究進(jìn)展迅速，這些研究為應(yīng)用植物基因工程與組織細(xì)胞工程相結(jié)合的生物學(xué)方法生產(chǎn)三萜皂苷提供了可能。最近研究表明，三萜皂苷可由異戊二烯途徑(isoprenoid pathway)合成，在2，3氧化鯊烯環(huán)化酶(2，3－oxidosqualene cyclases，OSCs)作用下使2，3氧化鯊烯環(huán)化形成齊墩果烷或達(dá)瑪烷三萜類骨架，然后經(jīng)細(xì)胞色素P450依賴性單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等介導(dǎo)進(jìn)行化學(xué)修飾，最終形成不同的三萜皂苷終產(chǎn)物。對(duì)此合成通路的詳盡了解有利于我們從源頭經(jīng)由單個(gè)或多個(gè)酶促過程調(diào)控三萜皂苷在植物或細(xì)胞中的合成。本文就三萜皂苷的生物合成途徑及其在藥用植物中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 三萜皂苷的生物合成途徑

異戊二烯途徑被認(rèn)為是三萜皂苷生成的必由途徑，可分為3個(gè)階段［1］。(1)起始階段:由甲羥戊酸(Mevalonic acid)生成異戊烯二磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)，IPP在香草二磷酸合成酶(GPS)的作用下形成香葉二磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)，而法呢二磷酸合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS)使GPP轉(zhuǎn)化成法呢二磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)。(2)骨架構(gòu)建階段:FPP在鯊烯合成酶(Squalene synthase，SS)的作用下合成鯊烯，然后經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase，SE)催化轉(zhuǎn)變?yōu)?，3－ 氧化鯊烯(2，3－ oxidosqualene)［2］。最后，2，3－氧化鯊烯經(jīng)過2，3－氧化鯊烯環(huán)化酶(2.3－oxidosqualene cyclase，OSCs)的環(huán)化作用生成植物三萜類骨架。(3)修飾階段:通過細(xì)胞色素P450單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶相繼對(duì)三萜類骨架進(jìn)行氧化、置換及糖基化等化學(xué)修飾，最終獲得不同類型的三萜皂苷產(chǎn)物。

2 鯊烯合成酶

SS酶在中間體環(huán)丙甲醇二磷酸介導(dǎo)下催化2個(gè)FPP分子形成具有還原性的二聚體。人參中SS酶廣泛分布于植株的各個(gè)部位，其中枝葉生長(zhǎng)點(diǎn)和根部的含量最高。SS酶的過表達(dá)可誘導(dǎo)下游信號(hào)通路中如SE，β－香樹脂合成酶(beta－amyrin synthase，β－AS)和環(huán)阿齊醇酶 (cycloarteno synthase，CAS)基因表達(dá)的上調(diào)，從而顯著增加三萜皂苷含量［3］。如將人參根中 SS酶轉(zhuǎn)基因至刺五加(Eleutherococcu senticosus)合子胚愈傷組織中，則轉(zhuǎn)基因植物的SS酶活性是野生型的3倍［4］。提示SS酶活性的升高不僅可增加三萜類皂苷的產(chǎn)量，其還是三萜皂苷合成中起關(guān)鍵作用的調(diào)控酶。

3 鯊烯環(huán)氧酶

SE酶亞細(xì)胞定位于質(zhì)體，其在鯊烯C=C之間插入1個(gè)氧原子形成環(huán)氧化物，即2，3－氧化鯊烯［5］。對(duì)三七總皂苷的研究發(fā)現(xiàn)三七鯊烯環(huán)氧酶由1611個(gè)核苷酸組成，編碼537個(gè)氨基酸殘基，其分子量為59.14 kDa，等電點(diǎn)為8.81，與人參鯊烯環(huán)氧酶同源性達(dá)到98%，而與其他SE酶家族成員的同源性差異較大。三七鯊烯環(huán)氧酶基因含有FAD功能區(qū)，Rossmann折疊的NAD(P)－結(jié)合區(qū)，F(xiàn)AD/NAD(P)－結(jié)合區(qū)，疏水的跨膜結(jié)構(gòu)，表明三七鯊烯環(huán)氧酶是一個(gè)膜蛋白。三七鯊烯環(huán)氧酶中含有WD domain，G－beta repeat保守結(jié)構(gòu)域，而人參中卻沒有該結(jié)構(gòu)域。三七鯊烯環(huán)氧酶基因在根中高表達(dá)，提示其表達(dá)具有組織特異性［6］。苜蓿中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)SE酶基因(SE1和SE2)與人參中的SE酶也具有同源性，分別為 77.1%和 74.4%［5］。茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)處理苜蓿后僅 SE2高表達(dá)，提示SE2可能在植物三萜類皂苷合成過程中起重要的作用。

4 氧化鯊烯環(huán)化酶

2，3－氧化鯊烯在OSCs酶的催化下，經(jīng)過一系列的質(zhì)子化作用、環(huán)化、重排和去質(zhì)子化作用形成三萜皂苷的前體物質(zhì)，如環(huán)阿齊醇(Cycloartenol)、原人參萜二醇(Protopanaxadiol)等。2，3－氧化鯊烯環(huán)化酶是一超家族，由5個(gè)蛇麻脂醇合成酶基因和7個(gè)五環(huán)三萜合成酶基因組成［7］。目前已從不同植物中分離出3個(gè)編碼OSCs酶的基因，即羽扇醇合成酶(Lupeolsynthase，LS)、β－ AS、達(dá)瑪烯二醇合成酶(Dammarenediolsynthase，DS)［1，5，8］。由于多數(shù)三萜皂苷是從齊墩果烷(Oleanane)和達(dá)瑪烯(Dammarane)衍化而來的，因此β－AS和DS酶可能對(duì)三萜類皂苷合成至關(guān)重要。Choi等［1］從MeJA處理的人參發(fā)根表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression sequcence tag，EST)中鑒定了3種OSCs酶。其中一種OSC酶與齊墩果烷的β－AS十分相似，其他2種與人參和豌豆中的β－AS十分相似，并具有催化氧化鯊烯產(chǎn)生單個(gè)環(huán)化產(chǎn)物的功能。MeJA處理光果甘草細(xì)胞可使大豆三萜皂苷合成通路中的SS酶，β－AS，OSC酶活性升高［8］。研究表明，編碼OSCs酶的基因較少且同源性較高［9］，而其產(chǎn)物也多達(dá)80余種，推測(cè)這一現(xiàn)象可能是由OSCs酶的氨基酸點(diǎn)突變引起［10］。

5 細(xì)胞色素P450和皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶

細(xì)胞色素P450是一酶蛋白家族，具有高度保守的FxxGxRxCxCx的結(jié)構(gòu)域。植物中細(xì)胞色素P450有94個(gè)家族，319個(gè)亞家族，2675條單一細(xì)胞色素P450基因［11］。細(xì)胞色素P450是一種以鐵卟啉為輔基的b族細(xì)胞色素，多催化羥化反應(yīng)。研究表明細(xì)胞色素P450依賴的單加氧酶和糖基轉(zhuǎn)移酶可修飾三萜碳環(huán)骨架形成三萜苷元。人參皂苷的三萜類苷元——原人參萜二醇在其作用下轉(zhuǎn)化成原人參萜三醇，最后在糖基轉(zhuǎn)移酶催化下使這些三萜類苷元添加1個(gè)或多個(gè)單糖得到不同的人參皂苷［2］。GT酶種類繁多但具有高度專一性。已知序列的糖基轉(zhuǎn)移酶沒有明顯的同源性，但有相似的結(jié)構(gòu)域。在三萜苷元合成皂苷時(shí)，原人參萜二醇型骨架C3和C20的羥基進(jìn)行了糖基化，形成了原人參萜二醇型人參皂苷。而原人參萜三醇則是C6和C20進(jìn)行了糖基化，形成了原人參萜三醇型人參皂苷［2］。因此，GT酶是人參皂苷代謝途徑上的一個(gè)關(guān)鍵酶。Vogt等［12］從表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫中鑒定了9種人參糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其中5種具有一個(gè)相同的PSPG序列保守域，PSPG參與植物次生代謝合成的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，通過對(duì)編碼和結(jié)構(gòu)域的研究，Choi等［1］也從EST數(shù)據(jù)庫中識(shí)別出25種細(xì)胞色素P450和5種β－糖苷酶候選基因序列。

綜上所述，三萜皂苷的生物合成途徑是一受多因素調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)變化過程，鑒于此合成通路中所涉及的各種中間產(chǎn)物和多種酶的復(fù)雜性，目前對(duì)三萜皂苷的合成機(jī)理認(rèn)識(shí)不詳。對(duì)萜類生物合成途徑和相關(guān)酶的研究為今后通過基因工程等手段實(shí)現(xiàn)調(diào)控三萜皂苷的生物合成調(diào)控奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

［1］Choi D W，Jung J，Ha Yi，et al.Analysis of transcripts in methyl jasmonate treated ginseng hairy roots to identify genes involved in the biosynthesis of ginsenosides and other secondary metabolites［J］.Plant Cell Rep，2005，23(8):557－566.

［2］Jung J D，Park H W，Hahn Y，et al.Discovery of genes for ginsenoside biosynthesis by analysis of ginseng expressed sequence tags［J］.Plant Cell Rep，2003，22(3):224－230.

［3］Lee M H，Jeong J H，Seo J W，et al.Enhanced triterpene and phytosterol biosynthesis in Panax ginseng overexpressing squalenesynthase gene［J］.Plant and Cell Physiol，2004，45(8):976－984.

［4］Seo J W，Jeong J H，Shin C G，et al.Overexpression of squalene synthase in Eleutherococcus senticosus increases phytosterol and triterpene accumulation［J］.Phytochemistry，2005，66(8):869－877.

［5］Suzuki H，Achnine L，Xu R，et al.A genomics approach to the early stages of triterpene saponin biosynthesis in Medicago truncatula［J］.Plant J，2002，32(6):1033－ 1048.

［6］He F，Zhu Y，He M，et al.Molecular cloning and characterization of the gene encoding squalene epoxidase in Panax notogiseng［J］.DNASeq，2008，19(3):270－273.

［7］Husselstein M T，Schaller H，Benveniste P.Molecular cloning and expression in yeast of 2，3－oxidosqualene－triterpenoid cyclases from Arabidopsis thaliana.Plant Mol Biol，2001，45:75－92.

［8］Hayashi H，Huang P，Inoue K.Up－regulation of soyasaponin biosynthesis by methyl jasmonate in cultured cells of Glycyrrhiza glabra［J］.Plant Cell Physiol，2003，44(4):404－411.

［9］Bohlmann J，Meyer－Gauen G，Croteau R.Plant terpenoid synthases:molecular biology and phylogenetic analysis［J］.PNAS，1998，95(8):4126－4133.

［10］Haralampidis K，Trojanowska M，Osbourn AE.Biosynthesis of triterpenoid saponins in plants［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2002，75:31－49.

［11］賀麗虹，趙淑娟，胡之璧.細(xì)胞色素P450基因與功能研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)，2008，15(2):142－147.

［12］Vogt T，Jones P.Glycosyltransferases in plant natural product synthesis:characterization of a supergene family［J］.Trends Plant Sci，2000，5(9):380－386.