aid A－aah基因及其編碼的糖基化黏附素AIDA－I的研究進(jìn)展

張 靜，姜中其

擴(kuò)散粘附性大腸桿菌（DAEC）對小腸粘膜的粘附是腹瀉發(fā)病中重要的一步。1988年從兒童腹瀉分離的DAEC能介導(dǎo)一種特殊的粘附—彌散型粘附［5］，介導(dǎo)這種粘附的蛋白被命名為 AIDA－I（adhesin involved in diff use adherence）。隨后研究發(fā)現(xiàn)AIDA－I不僅僅存在于人源致腹瀉大腸桿菌中，豬源大腸桿菌中也有分布。AIDA－I是一種多功能蛋白，能介導(dǎo)細(xì)菌粘附上皮細(xì)胞、細(xì)菌的自動凝集以及細(xì)菌生物膜的形成。AIDA－I在結(jié)構(gòu)上屬于自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，不需要其他分子的幫助就能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究對優(yōu)化其他蛋白的分泌具有重要作用。aid A－aah基因及其編碼的糖基化黏附素的研究從分子水平上揭示了病原菌黏附素與宿主細(xì)胞受體的相互作用和致病機(jī)制，對于控制疾病流行有重要意義；同時黏附素轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究對其他蛋白的分泌優(yōu)化表達(dá)也有重要作用。

1 黏附素AIDA－I的轉(zhuǎn)運(yùn)過程

黏附素AIDA－I屬于自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是TYPE Va途徑［1］組成革蘭氏陰性菌蛋白分泌的主要方式。AIDA－I黏附素是132 KDa的蛋白原的前體形式［2］，N端和C端都要加工后才能有活性［3］。轉(zhuǎn)運(yùn)過程一般分為3步［4］：1．蛋白原的前體形式從內(nèi)膜穿出，從其他自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)方式推測可能是sec分泌途徑。在這個過程中，N端的49個氨基酸組成的信號肽被切割，剩余的AIDA－I被釋放到細(xì)胞周質(zhì)中［5］；2．穿過外膜時，位于N端的14個二級結(jié)構(gòu)β－轉(zhuǎn)角在細(xì)胞外膜內(nèi)形成超二級結(jié)構(gòu)β－桶型結(jié)構(gòu)，相當(dāng)于在外膜內(nèi)行成“孔”，這個結(jié)構(gòu)類似于膜內(nèi)蛋白，被稱為β2，另外2個β－轉(zhuǎn)角位于細(xì)胞膜上，這16β結(jié)構(gòu)被稱為AIDA C［6］；3．成熟的 AIDA－I通過AIDAC結(jié)構(gòu)穿過外膜。AIDA－I在穿過細(xì)胞膜后被切割成2部分：45 k Da的AIDAc和100 k Da成熟的黏附素AIDA－I，后者以非共價鍵的形式與細(xì)胞膜相連，屬于鞭毛結(jié)構(gòu)。但這個切割過程對黏附素AIDA－I功能的發(fā)揮不是必需的［7］。溫和加熱可以使黏附素AIDA－I從細(xì)胞膜上分離，整個分泌過程不需要其他蛋白或分子的幫助。

研究人員對AIDA－I的轉(zhuǎn)運(yùn)過程提出過3種模型。模型一：發(fā)夾模型，是由Pohlner等提出的［8］，適用于大多數(shù)自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。但“發(fā)夾模型”受到了大腸桿菌淋球菌免疫球蛋白 A1（Ig A1）－蛋白酶轉(zhuǎn)位分子的挑戰(zhàn)。模型二：是由Veiga等提出“六聚物模型”［9］。適用于6個g A1－蛋白酶單體形成一個微孔使α結(jié)構(gòu)穿過，這個模型對理解自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有所幫助。模型三：由Oo men等人提出［11］。認(rèn)為外膜蛋白Omp85可能參與了折疊蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)，甚至可能有利于自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的折疊的完成［10］。Omp85已經(jīng)證實(shí)能夠幫助和保護(hù)自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白β－桶形結(jié)構(gòu)插入外膜中，提供微孔使黏附素通過。

2 aid A－aah基因結(jié)構(gòu)及其同源性的比較

aid A和aah基因是位于大腸桿菌的一個6 kbp的大質(zhì)粒上，兩者共同編碼糖基化黏附素AIDA－I，也被稱之為糖基化島，是一個毒力島［12］。aid A基因是編碼黏附素的主要基因，而位于aid A基因上游的aah基因是AIDA－I的修飾基因，aah基因編碼的是糖基轉(zhuǎn)移酶（autotransporter adhesion heptosyltransferase，AAH）。AAH能使18個庚糖轉(zhuǎn)移到1個ADIA－I上，最終形成成熟的100 KDa的糖基化蛋白AIDA－I［13］。以庚糖形式的糖基化蛋白在原核生物上是首次發(fā)現(xiàn)［14］。

不同來源致病菌aid A－aah基因及其表達(dá)的AIDA－I蛋白有一定的序列保守型和多樣性。分析致仔豬腹瀉大腸桿菌分離株aid A基因核苷酸序列表明開放性閱讀框（ORF）為3 864 bp，而人源致腹瀉大腸桿菌2 787菌株aid A的長度為3 861 bp，其同源性96．5%。但其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白部分的核苷酸序列的同源性為98．9%。兩類致病菌的aah基因核苷酸系列都是1 176 bp的ORF，同源性為99．8%，氨基酸同源性為99．5%［15］。

3 糖基化黏附素AIDA－I表達(dá)的調(diào)控

編碼糖基化黏附素AIDA－I的aid A－aah基因是以雙順反子形式轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的，啟動子有2個，分別是位于aah上游149和128核苷酸處［16］。另外aid A基因又有本身的啟動子啟動轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［17］。其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平受不同菌株和不同生長環(huán)境的影響。在營養(yǎng)缺乏，如高細(xì)胞密度下能夠獲得最大程度的表達(dá)。在hns和rf a H缺失菌中aid A－aah基因轉(zhuǎn)錄水平得到加強(qiáng)，另外，在不同大腸桿菌K－12菌株中轉(zhuǎn)錄水平不同。

4 黏附素AIDA－I的受體

研究發(fā)現(xiàn)AIDA－I能夠介導(dǎo)細(xì)菌結(jié)合多種類型的哺乳動物細(xì)胞，如Hela細(xì)胞、HT29人的克隆癌細(xì)胞、猴成纖維細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞等，表明其受體分布廣泛性和多樣性。AIDA－I在He La細(xì)胞上的結(jié)合蛋白是分子量為119 k Da N－端糖基化膜蛋白（gp119），PI大約為5．2［18］。有學(xué)者認(rèn)為豬小腸黏膜上皮細(xì)胞上的受體可能是Ig G Fc的結(jié)合蛋白［19］。

5 aid A基因和編碼的黏附素AIDA－I在細(xì)菌致病中的作用

黏附素AIDA－I是致人和豬腹瀉大腸桿菌的毒力因子，在腹瀉發(fā)病過程中具有重要的作用。AIDA－I能粘附上皮細(xì)胞、介導(dǎo)細(xì)菌的自動凝集和誘導(dǎo)生物膜的形成，是一種重要的多功能蛋白。細(xì)菌的自動凝集是通過AIDA－I高度特異性的相互作用形成的，膽酸鹽和去氧膽酸鈉能夠破壞AIDA－AIDA相互作用，從而阻止細(xì)菌通過群體和單細(xì)胞形式轉(zhuǎn)變而完成的感染［20］。AIDA－I能夠顯著加強(qiáng)細(xì)菌生物膜的形成，這種細(xì)菌生物膜的平均厚度能夠達(dá)到40μm［21］。AIDA介導(dǎo)的細(xì)胞的聚集需要細(xì)胞之間很近的接觸，F(xiàn)1菌毛（長度約1μm）能夠屏蔽和阻止形成AIDA介導(dǎo)的細(xì)胞聚集所必需的細(xì)胞之間近距離接觸，但是F1存在并不影響AIDA的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)。

2003年Ngeleka等［19］發(fā)現(xiàn)從腹瀉仔豬分離的大腸桿菌有20．5%是 AIDA－I／STb型［22］。2007年Ravi等發(fā)現(xiàn)豬源致腹瀉大腸桿菌臨床分離株P(guān)D20（AIDA－I＋、STb＋）經(jīng)過16～18 h孵育能導(dǎo)致腹瀉，而對照株 PD20 M（AIDA－I－、STb＋）不能致瀉。同時還發(fā)現(xiàn)AIDA－I＋大腸桿菌能夠介導(dǎo)細(xì)菌的自動凝集并能促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成。不同菌株雖然都能表達(dá)AIDA－I，但由于致病型不同，它們引起腹瀉的機(jī)制并不相同。［23］

6 總結(jié)和展望

目前已公認(rèn)，aid A－aah基因編碼的黏附素AIDA－I是致腹瀉大腸桿菌確定的毒力因子，能介導(dǎo)細(xì)菌對上皮細(xì)胞粘附、侵襲、細(xì)菌的自動聚集和生物膜的形成，在腹瀉的發(fā)生發(fā)展中均具有重要的作用。然而，關(guān)于該基因的表達(dá)調(diào)控、免疫學(xué)及致病機(jī)理等方面尚未完全闡明。AIDAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在優(yōu)化其他蛋白的分泌表達(dá)以及AIDA－I作為疫苗阻斷大腸桿菌作用上皮細(xì)胞的研究均具有重要意義。

［1］Henderson IR，Navarr o－Garcia F，Desvaux M，etal．Type V pr otein secretion pat h way：the autotransporter story［J］．Microbiol Mol Biol R，2004，68（4）：692－744．DOI：10．1128／MMBR．68．4．692－744．2004

［2］Char bonneau ME，Mourez M．Functional organization of the autotransporter adhesin involved in diff use adherence［J］．J Bacteriol，2007，189（24）：9020－9029．DOI：10．1128／JB．01238－07

［3］Maurer J，Jose J，Meyer T．Charaterization of the essential transport f unction of the AIDA－I and evidence supporting structual predictions［J］．J Bacteriol，1999，181（22）：7014－7020．

［4］Muller D，Benz I，Tapadar D，etal．Arrangement of the translocator of the autotransporter adhesin involved in diff use adherence on the bacterial surface［J］．Infect Immun，2005，73（7）：3851－3859．DOI：10．1128／IAI．73．7．3851－3859．2005

［5］Benz I，Sch midt MA．AIDA－I，the adhesin involved in diff use adherence of the diarr hoeagenic Escherichia coli strain 2787（O126：H27），is synthesized via a precursor molecule［J］．Mol Microbiol，1992，6（11）：1539－1546．DOI：10．1111／j．1365－2958．1992．tb00875．x

［6］Konieczny MP，Benz I，Hollinderb?u mer B，etal．Modular organization of the AIDA autotransporter translocator：The N－terminalβ1－do main is surface－exposed and stabilizes the transmembraneβ2－domain［J］．Anton Leeuw Int J，2001，80：19－34．DOI：10．1023／A：1012084325728

［7］Charbonneau ME，Berthiaume F，Mourez M．Proteolytic processing is not essential for multiple f unctions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diff use adherence （AIDA－I）［J］．J Bacteriol，2006，188（24）：8504－8512．DOI：10．1128／JB．00864－06

［8］Pohlner J，Halter R，Beyreuther K，etal．Gene structure and extrecellular secretion of Neisseria gonorrhoeae Ig A protease［J］．Nature，1987，325（29）：458－462．DOI：10．1038／325458a0

［9］Veiga E，Sugawara E，Nikaido H，etal．Export of aut otransported proteins proceeds t hr ough an oligo meric ring shaped by C－ter minal do mains［J］．Embo J，2002，21（9）：2122－2131．DOI：10．1093／emboj／21．9．2122

［10］Oo men CJ，Ulsen PV，Gelder PV，etal．Str ucture of the translocat or do main of a bacterial autotransporter［J］．Embo J，2004，23（6）：1257－1266．DOI：10．1038／sj．emboj．7600148

［11］Paschen SA，Waizenegger T，Stan T，etal．Evolutionary con－servation of biogenesis ofβ－barrel membrane proteins［J］．Nature，2003，426（6968）：857－862．DOI：10．1038／nature02208

［12］Her bert S，Michael H．Pat hogenicity islands in bacterial pat hogenesis［J］．Clin Micr obiol Rev，2004，17（1）：14－56．DOI：10．1128／CMR．17．1．14－56．2004

［13］Benz I，Sch midt MA．Glycosylation wit h hept ose residues mediated by the aah gene pr oduct is essential for adherence of the AIDA－I adhesin［J］．Mol Microbiol，2001，40（6）：1403－1413．DOI：10．1046／j．1365－2958．2001．02487．x

［14］Benz I，Sch midt MA．Never say never again：pr otein glycosylation in pat hogenic bacteria［J］．Mol Microbiol，2002，45（2）：267－276．DOI：10．1046／j．1365－2958．2002．03030．x

［15］Zhao LX，Chen X，Xu XJ，etal．Analysis of the AIDA－I gene sequence and prevalence in Escherichia coli isolates from pigs wit h post－weaning diarr hoea and oedema disease［J］．Vet J，2009，180（1）：124－129．DOI：10．1016／j．tvjl．2007．10．021

［16］Frederic B，Leblond MF，Harel J，etal．Gr owt h－phase－dependent expression of the operon coding for the glycosylated autotransporter adhesin AIDA－I of pat hogenic Escherichia coli［J］．Micr obiology，2010，311：176－184．DOI：10．1111／j．1574－6968．2010．02088．x

［17］Benz I，Alen TV，Bolte J，etal．Modulation of transcription and characterization of the pro moter organization of the autotransporter adhesin heptosyltransferase and the autotransporter adhesin AIDA－I［J］．Microbiology，2010，156（4）：1155－1166．DOI：10．1099／mic．0．032292－0

［18］Laar mann S，Sch midt MA．The Escherichia coli AIDA autotransporter adhesin recognizes an integral membrane glycoprotein as receptor［J］．Micr obiology，2003，149：1871－1882．DOI：10．1099／mic．0．26264－0

［19］Benz I，Sch midt MA．Isolation and ser ologic characterization of AIDA－I，the adhesin mediating the diff use adherence phenotype of the diarr hea－associated Escherichia coli strain 2787 （0126：H27）［J］．Infect Immun，1992，60（1）：13－18．

［20］Girard V，Cote JP，Char bonneau ME，etal．Confor mation change in a self－recognizing aut otransporter modulates bacterial cell－cell interaction［J］．J Biol Chem，2010，285（14）：10616－10626．DOI：10．1074／jbc．M109．069070

［21］Sherlock O，Schembri MA，Reisner A，etal．Novel roles for the AIDA adhesin from diarr heagenic Escherichia coli：cell aggregation and biofil m for mation［J］．J Bacteriol，2004，186（23）：8058－8065．DOI：10．1128／JB．186．23．8058－8065．2004

［22］Ravi M，Ngeleka M，Ki m SH，etal．Contribution of AIDA－I t o the pat hogenicit y of a porcine diarr heagenic Escherichia coli and to intestinal colonization t hrough biofil m for mation in pigs［J］．Vet Micr obiol，2007，120（3－4）：308－319．DOI：10．1016／j．vet mic．2006．10．035

［23］Pritchard J，Ngeleka M，Middleton DM．In vivo and in vitro colonization patterns of AIDA－I－positive Escherichia coli isolates from piglets with diarrhea［J］．J Vet Diagn Invest，2004，16：108－115．DOI：10．1177／104063870401600203