頂復(fù)門原蟲誘導(dǎo)宿主micro RNAs變化的研究進(jìn)展

范藝凡，周東輝，徐民俊，李成琳，朱興全，蔣文燦

頂復(fù)門（Apicomplexan）寄生蟲包括多種專性寄生于細(xì)胞內(nèi)的原蟲，有一些不僅嚴(yán)重危害人類和動物的健康，而且還給全球畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。其中，瘧原蟲（Pl asmodium）、隱孢子蟲（Cr y ptosporidiu m par vu m）、弓形蟲（Toxopl asma gondii）等危害比較嚴(yán)重［1］。為了保證在細(xì)胞內(nèi)生存，頂復(fù)門原蟲能精確地識別有利于它們發(fā)育的宿主細(xì)胞，并向宿主細(xì)胞內(nèi)分泌一些蛋白質(zhì)，從而干擾宿主信號通路（例如細(xì)胞凋亡，細(xì)胞因子的產(chǎn)生），改變宿主的防御性能［2－4］。雖然已有研究證明頂復(fù)門原蟲能改變宿主細(xì)胞環(huán)境，但具體改變的分子機制仍然不清楚。最近，頂復(fù)門原蟲誘導(dǎo)宿主micro RNAs（mi RNAs）表達(dá)水平變化的發(fā)現(xiàn)也許將為研究寄生蟲如何改變宿主體內(nèi)環(huán)境的分子機制提供新的線索［5－9］。

mi RNAs是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，它們通過與靶mRNAs的完全或不完全結(jié)合來降解或抑制靶m RNAs的翻譯，對動物和植物轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控起著重要的作用［10］。mi RNAs約占人類總基因的0．5%～1．5%，卻調(diào)控大約30%的基因轉(zhuǎn)錄，mi RNAs的靶基因分布廣泛，每個成熟的mi RNA可以抑制幾十甚至數(shù)百個靶mRNAs的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞生長、凋亡、發(fā)育、代謝、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和免疫反應(yīng)等［11－14］。

1 頂復(fù)門原蟲改變宿主體內(nèi)環(huán)境

1．1 Toll－like受 體 與 免 疫 應(yīng) 答 Toll－like受 體（TLRs）是一類識別病原微生物的重要蛋白質(zhì)。通過對弓形蟲、伯氏瘧原蟲（Pl asmodiu m ber ghei）、克氏錐蟲（Tr y panosoma cr uzi）等的研究，發(fā)現(xiàn) TLRs參與了宿主對入侵頂復(fù)門原蟲的識別［15－17］。弓形蟲感染宿主后，宿主通過依賴骨髓分化蛋白88（My D88）的 TLRs途徑促進(jìn)IFN－r的產(chǎn)生，因此TLRs途 徑 對 宿 主 抵 抗 弓 形 蟲 感 染 很 重 要［18－19］。TLRs受體激活一系列轉(zhuǎn)換蛋白（例如 My D88）最終導(dǎo)致一系列包括核因子（NF－k B），Janus激酶（JAK）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號途徑的激活。信號途徑的激活促使一系列宿主細(xì)胞抗病原蛋白轉(zhuǎn)錄的激活，然后產(chǎn)生抗微生物分子（例如促炎細(xì)胞因子、趨化因子和IL－12），最終將增強非特異性免疫［20－22］。為了維持免疫應(yīng)答平衡，上皮細(xì)胞對TLRs受體免疫信號通路進(jìn)行了負(fù)饋調(diào)控。例如，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的Src同源2蛋白（CIS）和細(xì)胞因子信號抑制物4（SOCS）將使致炎癥因子的產(chǎn)生得到明顯的抑制。最有代表性的SOCS家族成員是CIS和SOCSI－3蛋白質(zhì)，它們通過干擾JAK／STAT信號途徑來抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，在感染頂復(fù)門原蟲的機體中，識別病原的TLRs受體能誘導(dǎo)CIS／SOCS的表達(dá)和調(diào)控細(xì)胞因子受體的信號通路［23－26］。

1．2 向宿主細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白質(zhì) 當(dāng)寄生蟲侵入宿主細(xì)胞后，會分泌一些能改變宿主細(xì)胞環(huán)境的效應(yīng)分子，例如：弓形蟲利用棒狀體和致密顆粒分泌細(xì)胞器向宿主細(xì)胞注入一些有效因子。這些因子能幫助弓形蟲適應(yīng)宿主細(xì)胞環(huán)境，其中包括：①有助于弓形蟲侵入宿主細(xì)胞的棒狀體蛋白ROP16，它磷酸化STAT3和STAT6，從而降低白介素（IL－6，IL－2）的產(chǎn)生［27－28］。②ROP18磷酸化宿主細(xì)胞免疫相關(guān)的GTP酶，干涉細(xì)胞抵抗外來微生物入侵的途徑［29－30］。③GRA15，它是一種致密顆粒蛋白，激活宿主轉(zhuǎn)錄因子NF－k B［31］。④還有一種進(jìn)入宿主細(xì)胞核，但仍不清楚功能的蛋白磷酸化酶2C［32］。⑤UIS3是瘧原蟲在納蟲空泡膜內(nèi)分泌的一種蛋白質(zhì)，它結(jié)合肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白（L－FABP）幫助瘧原蟲攝取宿主的脂肪酸［33］。⑥泰勒蟲分泌一些蛋白質(zhì)同AT－h(huán)ook DNA結(jié)合基序連接，它們從寄生蟲轉(zhuǎn)運到宿主細(xì)胞核從而改變宿主基因表達(dá)［34］。⑦弓形蟲分泌的親環(huán)蛋白－18（C－18）能刺激宿主通過TLRs受體通路產(chǎn)生IL－12［35］。因此，寄生蟲能分泌一些特異的效應(yīng)分子調(diào)控宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（例如，STAT3和 NF－k B）。所以，有研究者推測這些寄生蟲分泌蛋白有助于改變宿主mi RNAs，從而重塑宿主體內(nèi)環(huán)境。

2 頂復(fù)門原蟲改變宿主mi RNAs的表達(dá)

mi RNAs在哺乳動物體內(nèi)的地位很重要，是免疫反應(yīng)的重要調(diào)控因子。因此，一些mi RNAs參與特異性免疫和非特異性免疫（例如，炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的增值，T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化）。它們?nèi)缤坏腊踩y門抵抗外來基因在機體內(nèi)表達(dá)，mi RNAs基因調(diào)控的失調(diào)將引發(fā)很多疾?。ɡ纾喊┌Y）。哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的mi R－NAs通過與病毒（例如水泡性口炎病毒、泡沫病毒、艾滋病毒）直接結(jié)合而清除它們［36－38］。擬南芥的mi R－393通過抑制生長素信號途徑來抵抗細(xì)胞外病原假單胞菌的入侵，與此同時，細(xì)胞外病原假單胞菌也分泌一些蛋白質(zhì)來抵抗小RNA介導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)［39－40］。由于病毒，細(xì)菌能改變被感染機體 mi RNAs的表達(dá)量，一些研究者開始研究頂復(fù)門寄生蟲是否也通過影響宿主mi RNAs的表達(dá)量，最終誘導(dǎo)宿主細(xì)胞環(huán)境的改變。

2．1 弓形蟲 研究者發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染宿主細(xì)胞后，將顯著改變宿主細(xì)胞mi RNAs表達(dá)。例如：Zeiner等發(fā)現(xiàn)人包皮成纖維細(xì)胞的mi R－17～92和mi R－106b～25隨著細(xì)胞感染弓形蟲后表達(dá)量將大量增加。然而，當(dāng)人包皮成纖維細(xì)胞感染犬新孢子蟲（Neospor a caninu m）后，mi R－17 家 族 mi RNAs的表達(dá)量卻沒有改變。不同的頂復(fù)門原蟲對宿主細(xì)胞mi R－17家族mi RNAs表達(dá)量的不同影響，表明不同的頂復(fù)門原蟲能夠用自己獨特的方式改變宿主一些mi RNAs的表達(dá)［9］。后來Zeiner等又用一系列引物延伸實驗進(jìn)一步證明了人包皮成纖維細(xì)胞在感染弓形蟲后，mi R－17家族 mi RNAs將顯著增加［41］。另外，已有研究表明，mi R－17～92能誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞增殖和分化，從而參與機體抵御病原體早期免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)節(jié)［42］。由此可見，弓形蟲在感染宿主后，能引起宿主某些mi RNAs表達(dá)的改變，從而引起宿主的急性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

2．2 隱孢子蟲 Let－7家族mi RNAs能在人類膽管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，感染了隱孢子蟲的人類膽管上皮細(xì)胞將導(dǎo)致pri－Let－7i和成熟Let－7表達(dá)量的降低，Let－7表達(dá)量的降低伴隨TLR4表達(dá)量的上調(diào)。在感染了隱孢子蟲的細(xì)胞中，Let－7與TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)的變化說明了mi RNAs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控途徑對頂復(fù)門原蟲感染的宿主細(xì)胞的基因調(diào)控很重要［5］。也有研究者發(fā)現(xiàn)，隱孢子蟲感染宿主后，將降低宿主 mi R－98和let－7的表達(dá)量，mi R－98或let－7與SOCS4的3末端非翻譯區(qū)結(jié)合將抑制SOCS4的翻譯，最終促進(jìn)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的Src同源2蛋白（CIS）和細(xì)胞因子信號抑制物4（SOCS）的表達(dá)。CIS和SOCS蛋白質(zhì)通過干擾JAK／STAT信號途徑來抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生［8］。以上數(shù)據(jù)充分表明宿主在感染隱孢子蟲后，會顯著改變與調(diào)控TLR信號途徑相關(guān)mi RNAs的表達(dá)量。這表明，依賴mi RNAs為基礎(chǔ)的調(diào)控途徑將有助于宿主防御反應(yīng)的產(chǎn)生。另外，隱孢子蟲還能降低膽管上皮細(xì)胞mi R－513表達(dá)水平，而且mi R－513能調(diào)控B7－H1蛋白［7］。

2．3 瘧原蟲 感染了夏氏瘧原蟲（Pl asmodiu m chabaudi mal aria）的肝臟細(xì)胞，將促進(jìn)編碼IL－1β，TNF－α，IFN－γ，NF－κ和i NOS蛋白的 m RNAs表達(dá)，而這些因子涉及天然免疫，并且調(diào)控宿主感染病原后的免疫反應(yīng)；同時降低CYP7 A1和SULT2 A2蛋白m RNA的表達(dá)，而這兩個蛋白與肝臟新陳代謝有關(guān)。另外，肝臟細(xì)胞的 mi R－26b，MCMV－mi RM23－1－5p，mi R－1274a表達(dá)量增加的同時降低了mi R－101b，let－7a，let－7g，mi R－193a－3p，mi R－192，mi R－142－5p，mi R－465d，mi R－677，mi R－98，mi R－694，mi R－374＊，mi R－450b－5p，mi R－464，mi R－377，mi R－20a＊ 和 mi R－466d－3p的表達(dá)量［43］。然而感染了瘧原蟲的肝臟，卻沒引起mi R－21的表達(dá)變化，而有研究者發(fā)現(xiàn)這個mi RNA涉及肝細(xì)胞的分化［44］。這些免疫因子和mi RNAs的動態(tài)變化證明宿主保護性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生結(jié)合了不同種類mi RNAs表達(dá)的重塑。岡比亞按蚊（Anopheles ga mbiae）感 染 瘧 原 蟲 后，Aga－mi R－34，aga－mi R－1174和 aga－mi R－1175表達(dá)量將降低，然而 agami R－989的表達(dá)量卻顯著升高。阻斷Dicer1和Ago1的mRNAs表達(dá)后將加強瘧原蟲感染岡比亞按蚊，說明這些mi RNAs調(diào)控岡比亞按蚊的免疫應(yīng)答［45］。由于隱孢子蟲和瘧原蟲感染不同種類的宿主或宿主細(xì)胞后，都將降低let－7家族mi RNAs的表達(dá)量，表明let－7在宿主感染寄生蟲后起重要作用。

3 展 望

隨著mi RNAs相關(guān)技術(shù)的日趨成熟，關(guān)于頂復(fù)門原蟲誘導(dǎo)宿主mi RNAs表達(dá)變化的研究將會越來越多。然而，一個關(guān)鍵性問題有待解決：頂復(fù)門原蟲感染宿主后，宿主mi RNAs的重塑是因為原蟲干擾了宿主mi RNAs通路，還是宿主對病原的一個普遍免疫應(yīng)答反應(yīng)？事實上，犬新孢子蟲和弓形蟲對宿主細(xì)胞mi R－17家族mi RNAs表達(dá)量的差異性影響［9］，表明頂復(fù)門原蟲對宿主mi RNAs的改變不只是由宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)引起。這些獨特的方式會是像病毒一樣通過自己的脫氧核苷酸改變宿主mi RNAs嗎［46］？有研究者推測弓形蟲通過分泌自己的mi RNAs來擊破宿主細(xì)胞mi RNAs防御途徑。弓形蟲能產(chǎn)生一系列包括mi RNAs在內(nèi)的內(nèi)源性小RNA，然而一些原蟲卻沒有mi RNA調(diào)控機制，例如：隱孢子蟲、瘧原蟲［47］。那么，不能產(chǎn)生mi RNAs的頂復(fù)門原蟲又是怎樣改變宿主mi RNAs的呢？也許，頂復(fù)門原蟲通過分泌到宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)來改變宿主mi RNAs。當(dāng)然，宿主mi RNAs的改變也可能由依賴識別病原的TLRs受體通路引起的。宿主外在的病原影響因子和自身的免疫應(yīng)答都可能改變宿主mi RNAs表達(dá)，從而重塑體內(nèi)環(huán)境。進(jìn)一步研究頂復(fù)門原蟲分泌到宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)和宿主mi RNAs之間的關(guān)系，或許將拓寬我們對頂復(fù)門原蟲與宿主相互影響分子機制的認(rèn)識。

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