吸血蠓分子分類研究進(jìn)展＊

王飛鵬，黃恩炯，肖 武，宋誠(chéng)本，王宇平

吸血蠓（Blood－sucking midges）是一類微小型昆蟲，屬雙翅目（Diptera）蠓科（Ceratopogonidae），幾乎廣泛分布于世界各地，可攜帶數(shù)十種人獸共患病病原，是醫(yī)學(xué)昆蟲的重要類群之一。蠓的分類研究最早記載于林奈的《Systema Nat urae》中，距今已有250余年的發(fā)展歷史，形成了較為成熟的分類體系［1］。但由于蠓科昆蟲中存在許多具有多處相似特征的隱種（cr yptic species）組成的復(fù)合體（co mplex）或種團(tuán)（gr oup），沿用傳統(tǒng)靠識(shí)別形態(tài)學(xué)特征的方法對(duì)這類群昆蟲進(jìn)行分類和鑒定往往較為困難，進(jìn)而也影響了對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化及其與病原生物關(guān)系的深入研究。因此，尋找可靠的分類鑒定方法，以期快速、準(zhǔn)確地識(shí)別蠓科昆蟲，尤其是吸血蠓，是現(xiàn)代昆蟲分類學(xué)家研究的重要內(nèi)容之一，也是蠓傳疾病防治工作的基礎(chǔ)。

分子分類技術(shù)是以遺傳物質(zhì)DNA序列分析為依據(jù)來(lái)闡明物種間的差別，從分子水平上快速而準(zhǔn)確地鑒別物種。它是分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)與傳統(tǒng)分類學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，作為一種嶄新的分類學(xué)技術(shù)，極大彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的缺陷，已引起越來(lái)越多生物學(xué)家們的重視。蠓科昆蟲的分子分類研究起步較遲，從1992年研究變翅庫(kù)蠓（Culicoides variipennis）種群的基因差異起［2］，才陸續(xù)有報(bào)道。近年來(lái)，隨著以PCR基礎(chǔ)的DNA序列測(cè)定方法的建立和廣泛使用，核糖體DNA（r DNA）的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、線粒體 DNA（mt DNA）的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ（COⅡ）等基因逐漸受到蠓科分類學(xué)家們的重視。本文就近幾年來(lái)吸血蠓的分子分類研究進(jìn)展綜述如下。

1 r DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的應(yīng)用

r DNA廣泛分布于各種生物細(xì)胞中，在功能上具有高度的保守性和良好的時(shí)鐘性，其測(cè)定序列常用于物種分類和生物間系統(tǒng)發(fā)育的研究，尤其是物種的種間分類研究［3－5］。目前r DNA作為遺傳標(biāo)記在寄生蟲鑒定中的應(yīng)用日趨廣泛，前人對(duì)此作了詳盡的描述［6－8］。ITS是位于r DNA 上18S和28S基因之間的區(qū)域片段，包括ITS1和ITS2兩段序列，由于該區(qū)域不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度較其他區(qū)域快，具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，加上協(xié)同進(jìn)化作用保證了該片段在基因組不同單元間的一致性，因而適合進(jìn)行各種分子操作，是較理想的種間鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的遺傳標(biāo)志［9－12］。近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)ITS序列標(biāo)記在蠓科昆蟲中的研究和應(yīng)用越來(lái)越多，r DNA的ITS1和ITS2序列在蠓類昆蟲的鑒定中發(fā)揮了重要的作用。

1．1 ITS1序列標(biāo)記 2004年，Cetre－Sossah等［13］通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，利用ITS1序列標(biāo)記建立了庫(kù)蠓屬（Culicoides spp．）和殘肢庫(kù)蠓（C．i micol a）的分子分類方法。研究發(fā)現(xiàn)：包括殘肢庫(kù)蠓（C．i micol a）在內(nèi)的9種庫(kù)蠓的ITS1序列長(zhǎng)度范圍在316－500 bp，其中，殘肢庫(kù)蠓（C．i micol a）有一條303 bp的特異性條帶；之后，Cetre－Sossah等［14］又提出以ITS1作為靶標(biāo)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，在殘肢庫(kù)蠓（C．i micol a）的監(jiān)測(cè)和研究項(xiàng)目上具有廣闊的應(yīng)用前景。Perrin等［15］再次對(duì)殘肢庫(kù)蠓（C．i micol a）進(jìn)行ITS1序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析，同源性高達(dá)99．8%，驗(yàn)證了ITS1在物種進(jìn)化和遺傳關(guān)系研究中的價(jià)值。Mathieu等［16］利用PCR技術(shù)對(duì)不顯庫(kù)蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）的ITS1序列進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)：雪翅庫(kù)蠓（C．chiopter us）、不顯庫(kù)蠓（C．obsoletus）、蘇格蘭庫(kù)蠓（C．scoticus）、丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）和山丘庫(kù)蠓（C．montanus）的同源性分別為98．93%、99．43%、98．33%、99．1%和98．47%，對(duì)這5種蠓的ITS1片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增表明，不顯庫(kù)蠓復(fù)合體均有一條166 bp的條帶，但雪翅庫(kù)蠓（C．chiopter us），丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）和不顯庫(kù)蠓（C．obsoletus）還分別有一條78 bp、117 bp、302 bp的條帶，山丘庫(kù)蠓（C．montanus）還有125 bp和302 bp條帶，而蘇格蘭庫(kù)蠓（C．scoticus）僅見(jiàn)166 bp這唯一的條帶。從遺傳關(guān)系看，不顯庫(kù)蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）中的丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）與殘肢庫(kù)蠓（C．i micol a）最為親近。Stephan［17］采用降落PCR法擴(kuò)增、克隆丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）的ITS1基因。結(jié)果表明：丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）有一條295 bp的特異性條帶，這一結(jié)論為丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）在不顯庫(kù)蠓復(fù)合體中的準(zhǔn)確鑒定提供了新的依據(jù)。Matsu moto［18］研究提出庫(kù)蠓的ITS1基因可根據(jù)堿基的缺失或插入情況不同分為長(zhǎng)型和短型兩種類型，并認(rèn)為長(zhǎng)型ITS1是庫(kù)蠓ITS1基因的原型，一些短型ITS1庫(kù)蠓是由于堿基缺失所引起，而二囊亞屬有其ITS1特異序列，并形成單系群。Li等［19］根據(jù)荒川庫(kù)蠓（C．a(chǎn)r aka wai）、淺色庫(kù)蠓（C．a(chǎn)lbicans）、肘臂庫(kù)蠓（C．cubitalis）等10種庫(kù)蠓的ITS1基因片段長(zhǎng)度，將10種庫(kù)蠓分為457－469 bp和316－347 bp兩群。從總體上看，10種庫(kù)蠓ITS1片段在288－388 bp的范圍出現(xiàn)一個(gè)高度保守的區(qū)域，由此提出可以在1－287 bp和385－500 bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)特異性引物，以ITS1為擴(kuò)增的靶標(biāo)序列，通過(guò)PCR的方法來(lái)鑒別各種庫(kù)蠓。

1．2 ITS2序列標(biāo)記 Go mulski等［20］對(duì)包括灰黑庫(kù)蠓復(fù)合體（pulicaris co mplex）在內(nèi)的11種庫(kù)蠓的r DNA－ITS2區(qū)基因進(jìn)行克隆和序列分析，推斷意大利主要庫(kù)蠓亞屬的系統(tǒng)發(fā)育。結(jié)果認(rèn)為庫(kù)蠓亞屬是由Culicoides sensu stricto，Sil vicol a，Hoff mania Fox和迄今不詳?shù)腇agineus復(fù)合體4個(gè)家系組成的多源聚合體。提出ITS2作為吸血蠓PCR擴(kuò)增的靶標(biāo)序列，不僅有利于鑒定蠓新種，還能有效輔助澄清庫(kù)蠓亞屬里的同種異名，分子鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定相佐證能夠解決吸血蠓形態(tài)學(xué)鑒定中的難題。Monaco等［21］提出以ITS2為標(biāo)記基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)準(zhǔn)確率高，比常規(guī)PCR更適合運(yùn)用于不顯庫(kù)蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）的快速鑒定，特別是在鑒定大規(guī)模不顯庫(kù)蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）標(biāo)本的情況下更具高效性。胡友蘭和李國(guó)清［22］對(duì)荒川庫(kù)蠓（C．a(chǎn)r aka wai）、變翅庫(kù)蠓（C．variipennis）和殘肢庫(kù)蠓（C．i micol a）等6種雙翅目昆蟲r DNA－ITS2的研究表明，雙翅目昆蟲ITS 2片段大小在不同屬間的差異很大，即使是同一屬的庫(kù)蠓，同源性也不高，最大為40．9%［荒川庫(kù)蠓（C．a(chǎn)r aka wai）與殘肢庫(kù)蠓（C．i micol a）］，荒川庫(kù)蠓（C．a(chǎn)r aka wai）與變翅庫(kù)蠓（C．variipennis）的同源性稍低，為32．7%。從而驗(yàn)證了真核生物ITS2序列具有高度變異性的特點(diǎn)，同時(shí)也說(shuō)明了ITS2片段作為庫(kù)蠓PCR鑒別的靶標(biāo)序列，能提供比較豐富的遺傳信息。

2 線粒體DNA（mt DNA）的應(yīng)用

線粒體DNA是細(xì)胞內(nèi)相對(duì)獨(dú)立的基因組，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因組小、易分離純化、序列順序和組成一般比較保守、嚴(yán)格遵循母系遺傳、單拷貝、進(jìn)化速率較核DNA快、無(wú)重組等特點(diǎn)，它的傳遞、重組、分離、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄都可應(yīng)用分子生物學(xué)的許多手段和方法進(jìn)行分析，是分子進(jìn)化遺傳研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［23－24］?，F(xiàn)已知線粒體的基因組至少含有13個(gè)蛋白質(zhì)基因，其中僅COⅠ、Cyt b、ND4、ND5這4個(gè)基因滿足基因插入和缺失現(xiàn)象較少、長(zhǎng)度在900 bp左右這兩個(gè)條件，但ND4、ND5進(jìn)化太快，不可能設(shè)計(jì)出通用引物，限制了它們作為全面DNA鑒定系統(tǒng)的目標(biāo)基因［25］。近年來(lái)線粒體COⅠ、COⅡ基因在蠓科昆蟲分類上的應(yīng)用較為廣泛，尤其是COⅠ基因，在一定程度上可作為傳統(tǒng)分類學(xué)的補(bǔ)充驗(yàn)證，推動(dòng)了蠓科昆蟲分子分類的研究進(jìn)展，但Cyt b在蠓的分子分類中至今未見(jiàn)報(bào)道。

2．1 細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因 自Hebert等［26－28］提出DNA條形碼技術(shù)并在全球開(kāi)展相關(guān)的協(xié)作研究后，COⅠ基因作為條形碼技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)目的基因推動(dòng)了以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的物種鑒定技術(shù)，目前已經(jīng)在脊椎動(dòng)物和昆蟲中得到廣泛研究［29－32］。在吸血蠓分子鑒定研究方面，Linton等［33］對(duì)殘肢庫(kù)蠓復(fù)合體（C．i micol a complex）中5種庫(kù)蠓的COⅠ基因進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：殘肢庫(kù)蠓復(fù)合體（C．i micol a complex）種間差異大，存在顯著的A－T堿基顛換。采用鄰接法（NJ）和最大簡(jiǎn)約法（MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分子系統(tǒng)樹(shù)顯示各蠓種間區(qū)別明顯。Dallas等［34］對(duì)殘肢庫(kù)蠓復(fù)合體（C．i micol a complex）的CO I基因研究表明，殘肢庫(kù)蠓CO I基因單體型的地理結(jié)構(gòu)與藍(lán)舌病病毒（BTV）的血清型具相關(guān)性。Pages and Sarto I Monteys［35］通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)CO I基因進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增、克隆，成功鑒定不顯庫(kù)蠓（C．obsoletus）和蘇格蘭庫(kù)蠓（C．scoticus）雌蟲，并且認(rèn)為形態(tài)學(xué)鑒定吸血蠓并不完全可靠，CO I基因可作為吸血蠓種間鑒定的遺傳標(biāo)志。Nolan等［36］也利用基于CO I基因的PCR方法快速準(zhǔn)確地鑒定灰黑庫(kù)蠓復(fù)合體（pulicaris co mplex）和不顯庫(kù)蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）。Pages等［37］又報(bào)道利用條形碼技術(shù)鑒定識(shí)別了庫(kù)蠓屬中的隱存種；同年，Sch wenkenbecher等［38］對(duì)不顯庫(kù)蠓復(fù)合體［obsolet us co mplex，含丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）］與灰黑庫(kù)蠓復(fù)合體（pulicaris co mplex）幼蟲的CO I基因進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析。研究表明CO I基因可作為分子標(biāo)記用于吸血蠓幼蟲的高通量鑒定。幼蟲的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：僅丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）在糞堆中有孳生，而其余庫(kù)蠓幼蟲多數(shù)孳生于水流或積水濕泥，這對(duì)掌握吸血蠓幼蟲的生態(tài)習(xí)性具有重要指導(dǎo)意義。Augot等［39］利用基于CO I基因的條形碼技術(shù)，同時(shí)結(jié)合對(duì)頭部、生殖器和胸部的形態(tài)測(cè)量，成功鑒定了88份不顯庫(kù)蠓（C．obsoletus）和蘇格蘭庫(kù)蠓（C．scoticus）雌蟲標(biāo)本。但是，利用基于CO I基因的DNA條形碼技術(shù)鑒定吸血蠓在我國(guó)至今未見(jiàn)報(bào)道。

2．2 細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ（COⅡ）基因 COⅡ序列具有很高的趨異性，尤其是在一些雙翅目和膜翅目昆蟲中，COⅡ基因序列和氨基酸順序均表現(xiàn)出高度的趨異性［40］，因此，COⅡ基因序列在這類昆蟲的進(jìn)化機(jī)制及系統(tǒng)發(fā)育研究方面是一種非常有效的分子標(biāo)記。通過(guò)分析臺(tái)灣地區(qū)臺(tái)灣蠛蠓（Lasiohelea tai wana）的COⅡ基因序列發(fā)現(xiàn)：不同臺(tái)灣蠛蠓（La．tai wana）個(gè)體間核苷酸分化程度可高達(dá)2．7%。群體內(nèi)以及群體間的平均變異水平在0．7% 左右。因此，遺傳交流可能是導(dǎo)致如今臺(tái)灣地區(qū)臺(tái)灣蠛蠓（La．tai wana）種群組成多元化的原因［41］。對(duì)蚊科、蠓科、搖蚊科以及蚋科等昆蟲的COII序列分析表明蠓群體間的分化程度較大，其在所屬的科中屬于較古老的種，而且相對(duì)于其他雙翅目長(zhǎng)角亞目昆蟲具有更為顯著的序列進(jìn)化［42］。

3 結(jié) 語(yǔ)

尋求快速、準(zhǔn)確、可靠的吸血蠓種類鑒定技術(shù)，不僅是口岸一線檢疫工作人員開(kāi)展檢疫工作和有效防制蠓傳疾病的重要基礎(chǔ)，更是生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)新種和隱存種，重建物種和高級(jí)階元的演化關(guān)系，豐富生物資源的有效途徑。雖然分子分類與鑒定技術(shù)興起時(shí)間較晚，但其正以穩(wěn)步、快速的態(tài)勢(shì)發(fā)展。吸血蠓分子水平上的研究不僅有助于準(zhǔn)確地分類鑒定，也將有利于對(duì)其媒介功能的研究。目前，分子生物學(xué)技術(shù)已多見(jiàn)于吸血蠓種團(tuán)、復(fù)合體的分類鑒別中，少數(shù)也涉及到種群分化的研究，這將為解決蠓科研究中存有爭(zhēng)議的問(wèn)題提供指導(dǎo)性資料。當(dāng)今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)吸血蠓的分子分類已做了大量研究工作，但都仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，各種分子分類應(yīng)用的靶標(biāo)基因有優(yōu)點(diǎn)也存在其一定的局限性。核糖體DNA上的ITS區(qū)域序列進(jìn)化速度快，在物種水平上變異較大，序列多態(tài)性強(qiáng)并含有足夠量的遺傳信息，已被廣泛用于物種分類及系統(tǒng)進(jìn)化研究，但是這些基因中存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，從而使序列比對(duì)受到障礙，不便操作，而且還容易造成錯(cuò)誤的比對(duì)［43］?；诰€粒體基因編碼的DNA條形碼技術(shù)及其應(yīng)用前景雖被眾多學(xué)者所看好，但也有學(xué)者認(rèn)為如此短的DNA片段不能提供物種水平的可靠信息，完全依靠 DNA 條形碼會(huì)導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤［44－45］。更有人認(rèn)為采用DNA條形碼技術(shù)將是一種倒退，會(huì)將分類學(xué)退回到類型學(xué)［46－47］。在利用任何一個(gè)基因或多個(gè)基因片段進(jìn)行物種分類和種屬鑒定時(shí)，不能只考慮所選用標(biāo)記基因的片段長(zhǎng)度，而應(yīng)該結(jié)合序列組成及其同源性綜合評(píng)價(jià)。例如，Sch wenkenbecher［48］選用ITS1、ITS2和 COⅠ3個(gè)靶標(biāo)基因通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析提出了丘夫庫(kù)蠓（C．dewul f i）不應(yīng)屬于不顯庫(kù)蠓復(fù)合體的觀點(diǎn)。鑒于此，分子分類技術(shù)依舊無(wú)法完全取代傳統(tǒng)的吸血蠓分類鑒定方法，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)手段不能完全拋棄。

總之，分子分類技術(shù)目前所表現(xiàn)出的局限性不應(yīng)是其應(yīng)用和發(fā)展的阻礙，對(duì)于其面臨的問(wèn)題，可以探索、嘗試新的分子標(biāo)記及多個(gè)分子標(biāo)記相結(jié)合使用來(lái)解決，同時(shí)也不排斥其他分類方法，包括生物化學(xué)、計(jì)算機(jī)數(shù)值分類學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)等方法，多層次、多方面、系統(tǒng)地研究吸血蠓分類，這樣就更能反映吸血蠓的種群進(jìn)化和親緣關(guān)系。今后，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，吸血蠓的分子分類技術(shù)也將不斷地進(jìn)步和成熟。充分發(fā)揮分子分類技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，利用分子分類技術(shù)與傳統(tǒng)的分類方法相互佐證，將大大有助于吸血蠓的分類鑒定。

［1］Yu YX．Ceratopogonidae of China［M］．Beijing：Press of Military Medical Sciences．2006：3－4．（in Chinese）虞以新．中國(guó)蠓科昆蟲［M］．北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社．2006，3－4．

［2］Tabachnick WJ．Genetic differentiation a mong populations of Culicoides variipennis （Diptera：Ceratopogonidae），the North American vector of bluet ongue vir us［J］．Ann Ento mol Soc Am，1992，85（2）：140－147．

［3］Dover G．Molecular drive：a cohesive mode of species evol ution［J］． Nature，1982，299 （5879） ：111－117．DOI：10．1038／299111a0

［4］Hillis DM，Davis SK．Riboso mal DNA：intraspecific poly morphism，concerted evolution and phylogeny reconstruction ［J］．Syst Zool，1988，37（1）：63－66．DOI：10．2307／2413191

［5］Hillis DM，Dixon MT．Riboso mal DNA：molecular evol ution and phylogenetic inference［J］．Q Rev Biol，1991，66（4）：411－453．DOI：10．1086／417338

［6］Gajahar AA，Marquardt WC，Hall R，etal．Ribosomal RNA sequence of Sarcocystis muris，Theileria annul ata and Cr ypthecodiniu m cohnii reveal evol utionary relationship among apico mlexan，dinoflagellates and ciliates ［J］．Mol Biochem Parasitol，1991，45（1）：147－154．DOI：10．1016／0166－6851（91）90036－6

［7］Ellis J，Hefford C，Baverstock PR，etal．Ribosomal DNA sequence comparison of Babesia and Theileria ［J］．Mol Biochem Parasitol，1992，54（1）：97－96．DOI：10．1016／0166－6851（92）90097－4

［8］Allsopp MT，Cavalier－Smith T，De Waal DT，etal．Phylogeny and evolution of the piroplas ms［J］．Parasitology，1994，108：147－152．DOI：10．1017／S0031182000068232

［9］Paskewitz SM，Wesson DM，Collins FH．The inter nal transcribed spacers of riboso mal DNA in five members of the Anopheles ga mbiae species co mplex［J］．Insect Mol Biol，1993，2（4）：247－257．DOI：10．1111／j．1365－2583

［10］Kuhls K，Mauricio IL，Pratlong F，etal．Analysis of riboso mal DNA inter nal transcribed spacer sequences of the Leish mania donovani co mplex ［J］．Microbes Infect，2005，7 （11／12）：1224－1234．DOI：10．1016／j－micinf．2005．04．009

［11］Niu QL，Luo JX，Yin H．Advances and application of r DNAITS in the molecular taxonomy of parasite［J］．Chin J Vet Parasitol，2008，16（4）：41－47．（in Chinese）牛慶麗，羅建勛，殷宏．轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）在寄生蟲分子生物學(xué)分類中的應(yīng)用及其進(jìn)展［J］．中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病，2008，16（4）：41－47．

［12］Li XJ，Yang YM．Application of ribosomal DNA internal transcribed spacer in parasites［J］．J Dali Univ，2008，7 （4）：79－81．（in Chinese）李曉娟，楊毅梅．核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列標(biāo)記在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用［J］．大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，7（4）：79－81．

［13］Cetre－Sossah C，Baldet T，Delecolle JC，etal．Molecular detection of Culicoides spp．a(chǎn)nd Culicoides i micol a，the principal vector of bluet ongue（BT）and African horse sickness（AHS）in Africa and Europe［J］．Vet Res，2004，35（3）：325－337．DOI：10．1051／vetres：2004015

［14］Cetre－Sossah C，Mat hieu B，Setier－Rio ML，etal．Develop ment and evaluation of a real－ti me quantitative PCR assay for Culicoides i micola，one of the main vectors of bluetongue（BT）and African horse sickness（AHS）in Africa and Europe［J］．Res Vet Sci，2008，85（2）：372－382．DOI：10．1016／j．rvsc．2007．12．001

［15］Perrin A，Cetre－Sossah C，Mat hieu B，etal．Phylogenetic analysis of Culicoides species from France based on nuclear ITS1－r DNA sequences［J］．Med Vet Ento mol，2006，20（2）：219－228．DOI：10．1111／j．1365－2915．2006．00616．x

［16］Mat hieu B，Perrin A，Baldet T，etal．Molecular identification of wester n Eur opean species of Obsolet us co mplex （Diptera：Ceratopogonidae）by an internal transcribed spacer－1 r DNA multiplex poly merase chain reaction assay［J］．J Med Ento mol，2007，44（6）：1019－1025．DOI：10．1603／0022－2585（2007）44［1019：MIOWES］2．0．CO；2

［17］Stephan A，Clausen PH，Bauer B，etal．PCR identification of Culicoides dewul f i midges（Diptera：Ceratopogonidae），potential vectors of bluetongue in Ger many［J］．Parasitol Res，2009，105（2）：367－371．DOI：10．1007／s00436－009－1407－z

［18］Matsu moto Y，Yanase T，Tsuda T，etal．Charceterization of inter nal transcribed spacer （ITS1）－ITS2 region of riboso mal RNA gene from 25 species of Culicoides biting midges（Diptera：Ceratopogonidae）in Japan［J］．J Med Entomol，2009，46（5）：1099－1108．DOI：10．1603／033．046．0517

［19］Li GQ，Hu YL，Kanu S，etal．PCR amplification and sequencing of ITS1 r DNA of Culicoides ar akawai［J］．Vet Parasitol，2003，112（1－2）：101－108．

［20］Gomulski L M，Meiswinkel R，Delecolle JC，etal．Phylogeny of the subgenus Culicoides and related species in Italy，inferred from inter nal transcribed spacer 2 riboso mal DNA sequences［J］．Med Vet Ento mol，2006，20（2）：229－238．DOI：10．1111／j．1365－2915．2006．00620．x

［21］Monaco F，Benedetto L，Marcello VD，etal．Develop ment and preli minary evaluation of a real－ti me poly merase chain reaction for the identification of Cuilcoides obsolet us sensu strict u，C．scoticus and C．montanus in the Obsoletus Co mplex in Italy［J］．Vet Ital，2010，46（2）：215－220．

［22］Hu YL，Li GQ．Sequencing and analysis of ITS2 r DNA sequences of the midge（Culicoides arakawae）［J］．Acta Zoological Sinica，2003，49（2）：277－280．（in Chinese）胡友蘭，李國(guó)清．荒川庫(kù)蠓r DNA ITS2的序列測(cè)定與分析［J］．動(dòng)物學(xué)報(bào)，2003，49（2）：277－280．

［23］Wang TC，Liu CL，Xiao LZ．Research Progression in mt DNA［J］．J Anhui Agri Sci，2006，34（10）：2068，2071．（in Chinese）汪泰初，劉朝良，肖林珍．線粒體基因組（mt DNA）的研究進(jìn)展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（10）：2068，2071．

［24］Gray M．Origin and evol ution of mit ochondrial DNA［J］．Ann Rev Cell Biol，1989，5：25－50．DOI：10．1146／annurev．cb．05．110189．000325

［25］Ma Y，Research on identification of s mall mammals and parasitic fleas by DNA barcoding in Qinghai Province，China［D］．Beijing：Chinese Center for Disease and Prevention of China，2010：1－10．（in Chinese）馬英．DNA條形碼技術(shù)在青海省小型獸類及寄生蚤鑒定中的應(yīng)用研究［D］．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心．2010．

［26］Heber PD，Cy winska A，Bali SL，etal．Biological identifica－tions t hr ough DNA barcodes［J］．Proc Biol Sci，2003，270（1512）：313－321．DOI：10．1098／rspb．2002．2218

［27］Hebert PD，Ratnasingham S，de Waard JR．Barcoding animal life：cytochr o me coxidase subunit 1 divergences a mong closely related species［J］．Proc Biol Sci，2003，270：S96－S99．DOI：10．1098／rsbl．2003．0025

［28］Hebert PD，Penton EH，Bur ns JM，etal．Ten species in one：DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astr aptes f ul ger ator［J］．Pr oc Natl Acad Sci U S A，2004， 101 （41 ）： 14812－14817． DOI： 10． 1073／pnas．0406166101

［29］Li LZ，Huang ZX．Pr ogresses in cytochr o me C oxidase studies［J］．J Inorg Chem，2001，17（6）：761－774．（in Chinese）李連之，黃仲賢．細(xì)胞色素C氧化酶研究新進(jìn)展［J］．無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2001，17（6）：761－774．

［30］Bai GR，Lu SM．The progress of the mitochondrial DNA encoding cytochr o me oxidase subunit gene［J］．Foreign Med Sci Sect Med Mol Biol，2003，25（6）：354－357．（in Chinese）柏干榮，陸松敏．線粒體DNA編碼細(xì)胞色素氧化酶亞基基因的進(jìn)展［J］．國(guó)外醫(yī)學(xué) （分子生物學(xué)分冊(cè)），2003，25（6）：354－357．

［31］Skelly PJ，Stein LD，Shoemaker CB．Expression of Schistosoma mansoni genes involved in anaer obic and oxidative glucose metabolism during the cercaria to adult transfor mation［J］．Mol Biochem Parasit ol，1993，60（1）：93－104．DOI：10．1016／0166－6851（93）90032－S

［32］Magzoub M，Maegrait h BG，F(xiàn)letcher KA．The oxidative metabolis m of Schistoso ma mansoni and the effects of antischistoso mal dr ugs and cytochr o me oxidase inhibit ors［J］．Ann Trop Med Parasitol，l971，65（1）：31－44．

［33］Linton Y M，Mor due AJ，Cr uickshank RH，etal．Phylogentic analysis of the mitochondrial cytochr o me oxidase subunit I gene of five species of the Culicoides i micola species co mplex ［J］．Med Vet Entomol，2002，16（2）：139－146．DOI：10．1046／j．1365－2915．2002．00356．x

［34］Dallas JF，Cr uickshank RH，Linton Y M，etal．Phylogenetic status and matrilineal structure of the biting midge，Culicoides i micol a，in Port ugal，Rhodes and Israel［J］．Med Vet Ento mol，2003，17（4）：379－387．

［35］Pages N，Sarto I，Monteys V．Differentiation of Culicoides obsoletus and Culicoides scoticus （Diptera：Ceratopogonidae）based on mitochondrial cytochrome oxidase subunit I ［J］．J Med Entomol，2005，42（6）：1026－1034．DOI：10．1603／0022－2585（2005）042［1026：DOCOAC］2．0．CO；2

［36］Nolan DV，Carpenter S，Barber J，etal．Rapid diagnostic PCR assays for members of the Culicoides obsoletus and Culicoides pulicaris species co mplexes，i mplicated vectors of bluetongue virus in Europe［J］．Vet Microbiol，2007，124（1／2）：82－94．DOI：10．1016／j．vet mic．2007．03．019

［37］Pages N，Munoz－Munoz F，Talavera S，etal．Identification of cr yptic species of Culicoides（Diptera：Ceratopogonidae）in the subgenus Culicoides and develop ment of species－specific PCR assays based on barcode regions［J］．Vet Parasit ol，2009，165（3／4）：298－310．DOI：10．1016／j．vet par．2009．07．020

［38］Sch wenkenbecher JM，Mordue AJ，Switek K，etal．Discri mination of Culicoides midge lar vae using multiplex poly merase chain reaction assays based on DNA sequence variation at the mitochondrial cytochro me C oxidase I gene ［J］．J Med Entomol，2009，46（3）：610－614．DOI：10．1603／033．046．0328

［39］Augot D，Sauvage F，Jouet D，etal．Discri mination of Culicoides obsoletus and Culicoides scoticus，potential bluetongue vectors，by mor pho metrical and mitochondrial cytochr o me oxidase subunit I analysis［J］．Infect Genet Evol，2010，10 （5）：629－637．DOI：10．1016／j．meegid．2010．03．016

［40］Liu H，Beckenbach A．Evolution of the mit ochondrial cytochr o me oxidase Ⅱ gene a mong 10 orders of insects［J］．Mol Phylogenet Evol，1992，1（1）：41－52．

［41］Yeh WB，Lee H M，Tu WC，etal．Molecular differentiation and diversity of Forcipomyia tai wana （Diptera：Cerat opogonidae）based on the mitochondrial cytochr o me oxidaseⅡsequence［J］．J Med Ento mol，2009，46（2）：249－256．DOI：10．1603／033．046．0209

［42］Beckenbach AT，Bor kent A．Molecular analysis of the biting midges（Diptera：Ceratopogonidae），based on mitochondrial cytochr o me oxidase subunit 2［J］．Mol Phylogenet Evol，2003，27（1）：21－35．DOI：10．1016／S1055－7903（02）00395－0

［43］Liu Y，Song Y，Li XY．Application of DNA barcoding based on mit ochondrial cytochr o me C oxidase I gene in molecular identification of insects［J］．Plant Quarantine，2010，24（2）：46－50．（in Chinese）劉勇，宋毓，李曉宇．基于線粒體CO I基因的DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分子鑒定中的應(yīng)用［J］．植物檢疫，2010，24（2）：46－50．

［44］Will K W，Rubinoff D．Myt h of the molecule：DNA barcodes for species cannot replace mor phology for identification and classification［J］．Cladistics，2004，20（1）：47－55．DOI：10．1111／j．1096－0031．2003．00008．x

［45］Ebach MC，Holdrege C．DNA barcoding is no substitute for taxono my［J］．Nature，2005，434（7034）：697．DOI：10．1038／434697b

［46］Mallet J，Will mott K．Taxono my：renaissance or Tower of Babel［J］．Trends Ecol Evol，2003，18（2）：57－59．DOI：10．1016／S0169－5347（02）00061－7

［47］Will K W，Mishler BD，Wheeler QD．The perils of DNA barcoding and the need for integrative taxono my［J］．Syst Biol．2005，54（5）：844－851．DOI：10．1016／S0169－5347（02）00061－7

［48］Sch wenkenbecher JM，Mor due AJ，Piertney SB．Phylogenetic analysis indicates that Culicoides dewul f i should not be considered part of the Culicoides obsolet us co mplex［J］．Bull Ento mol Res，2009，99（4）：371－375．DOI：10．1017／S0007485308006391