大孔樹脂純化穿心蓮內(nèi)部沸騰提取液的工藝研究

彭夢(mèng)微，韋藤幼，陳曉光，童張法

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004)

穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.F.)Nees為爵床科穿心蓮屬植物，藥用部位為其葉和梗，其有效成分穿心蓮內(nèi)酯類化合物具有清熱解毒、涼血消腫等功效，對(duì)呼吸道感染、急性菌痢、腸胃炎、感冒發(fā)熱、糖尿病及癌癥等疾?。?～5］具有一定的療效。穿心蓮提取液的初步純化工藝多采用大孔吸附樹脂法，如范去鴿等［6］用ADS-7樹脂對(duì)傳統(tǒng)的乙醇回流提取液進(jìn)行純化，分離干燥后得到的浸膏中含穿心蓮內(nèi)酯25.3%;吳嬌等［7］采用DA201樹脂吸附，分離干燥后得到的浸膏中穿心蓮內(nèi)酯量達(dá)47%。由于穿心蓮葉子中葉綠素含量較高，傳統(tǒng)的乙醇回流法制得提取液中色素量高，上柱前還需經(jīng)濃縮處理。經(jīng)濃縮后的上柱液較渾濁，致使大孔吸附樹脂易被色素堵塞、污染，使其分離效果降低，再生周期縮短。

減壓內(nèi)部沸騰法［8-9］是一種低溫快速提取方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)采用該法制得的穿心蓮提取液進(jìn)行了大孔吸附樹脂吸附純化研究，并與回流提取液［10］純化進(jìn)行比較，為含有高葉綠素中藥的分離純化提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料穿心蓮(南寧藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地廣西);穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇(一級(jí)色譜純，天津四友化學(xué)藥劑有限公司);乙醇(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠);大孔樹脂HPD-100、AB-8、X-5、D-4020、NKA-9和D-101(南開大學(xué)化工廠)。

1.2 儀器CBM-10A vp型高效液相色譜儀(日本島津公司);SHB-ⅢT型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);HZS-H型恒溫振蕩水槽(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DHL-A型電腦恒流泵(上海青浦滬西儀器廠);PC2501紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取液制備

1.3.1.1 減壓內(nèi)部沸騰法稱取10.0 g穿心蓮粉末，用10 mL 80%乙醇溶液均勻潤(rùn)濕30 min，使乙醇溶液充分滲透物料;加入12倍量溫度為59℃的32%乙醇溶液，迅速減壓至表壓為－0.074 MPa，提取4 min后，卸壓，過(guò)濾，得到穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量濃度為1.95 mg/mL的提取液，備用。

1.3.1.2 乙醇回流法稱取10.0 g穿心蓮粉末，于500 mL圓底燒瓶中，用85%乙醇回流提取2次，每次2 h，第一次10倍量，第二次8倍量，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮液加入95%的乙醇溶液，配制成含乙醇量為32%的上柱液，備用。

1.3.2 大孔吸附樹脂純化

1.3.2.1 樹脂的篩選分別稱取預(yù)處理過(guò)的HPD-100、AB-8、X-5、D-4020、NKA-9和D-101樹脂0.50 g置于具塞磨口三角瓶中，加入減壓內(nèi)部沸騰法制得的提取液50 mL，25℃恒溫振蕩24 h，測(cè)定吸附后剩余液中穿心蓮內(nèi)酯的濃度。將達(dá)吸附平衡的樹脂過(guò)濾取出，再用50 mL 75%乙醇，在25℃恒溫振蕩24 h進(jìn)行解吸，測(cè)定解吸液中穿心蓮內(nèi)酯的濃度，計(jì)算平衡吸附量和解吸率，確定被采用的樹脂。

1.3.2.2 吸附工藝條件的確定稱取10.0 g預(yù)處理過(guò)的HPD-100樹脂裝入層析柱(10 mm×300 mm，柱床體積為20 mL)中，將350 mL提取液以一定的流速通入柱中，分部收集流出液，測(cè)定各部分流出液中穿心蓮內(nèi)酯的濃度，作樹脂的泄露曲線，考察上樣流速對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響。

1.3.2.3 洗脫工藝條件的確定樹脂吸附完成后，用150 mL一定濃度的乙醇水溶液以一定的流速進(jìn)行洗脫，考察含乙醇量、體積流量對(duì)洗脫效果的影響，確定最佳洗脫劑濃度并繪制洗脫曲線。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 穿心蓮內(nèi)酯的測(cè)定［11］采用高效液相色譜法，色譜條件為Wondersil C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)色譜柱，體積流量1.0 mL/min;流動(dòng)相為甲醇-水(52∶48，V/V)，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm;進(jìn)樣量20 μL;室溫。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取真空干燥后的標(biāo)準(zhǔn)品穿心蓮內(nèi)酯6.5 mg，用甲醇溶解，待完全溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得0.028 9 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取2、4、6、8、10 μL，按以上色譜條件測(cè)定峰面積，進(jìn)樣量X與峰面積Y的回歸方程為Y=544 820X+507 9.3(R2=0.999 9)。

1.3.3.3 色素的相對(duì)含有量測(cè)定［12］采用紫外可見分光光度法，將提取液和泄漏液配制成單位提取物相同量，在波長(zhǎng)為670 nm下測(cè)定吸光度，樹脂殘留色素量A=A提取液－A泄露液。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 樹脂的篩選表1為6種大孔樹脂的物理性質(zhì)及其對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的平衡吸附量和解吸率的測(cè)定結(jié)果。

表1 樹脂的物理性質(zhì)及其平衡吸附量和解吸率

由表1可以看出，吸附量順序?yàn)镠PD-100＞D-101＞AB-8＞X-5＞D-4020＞NKA-9，而解吸率順序?yàn)镈-101＞HPD-100＞AB-8＞D-4020＞X-5＞NKA-9。穿心蓮內(nèi)酯極性較小，一般是選用弱極性或非極性的樹脂。HPD-100樹脂的比表面最大，其吸附量最大，雖然其孔徑最小，但由于穿心蓮內(nèi)酯分子體積并不很大，對(duì)解吸的影響不大，因而選擇HPD-100較為理想。

2.2 吸附工藝條件的確定不同上樣體積流量，HPD-100樹脂對(duì)內(nèi)部沸騰提取液的動(dòng)態(tài)吸附性能如圖1所示。

圖1 不同體積流量下HPD-100樹脂吸附穿心蓮內(nèi)酯的泄露曲線

由圖1知，泄露穿心蓮內(nèi)酯量達(dá)到總量(C/C0)的0.05時(shí)，上柱體積流量為0.5、1、2 mL/min對(duì)應(yīng)的上柱液體積分別為175、150、75 mL。從吸附效果考慮，低速操作有利，但在實(shí)際應(yīng)用中，必須考慮單位時(shí)間的處理能力。比較可知，體積流量為0.5 mL/min的吸附效果比1 mL/min好，但處理量增加的幅度不大。因此，上柱體積流量以1 mL/min為宜，上柱體積為150 mL。

2.3 洗脫工藝條件的確定對(duì)上柱體積流量以1 mL/min吸附的柱，依次采用15%～55%乙醇溶液對(duì)穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行梯度洗脫(見圖2)。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇梯度洗脫所得穿心蓮內(nèi)酯的純度和得率

由圖2可以看出，15%、25%的乙醇水溶液對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的洗脫能力較差，洗脫液中穿心蓮內(nèi)酯的量很少。當(dāng)含乙醇量增至35%時(shí)，隨著含乙醇量的升高，洗脫液中穿心蓮內(nèi)酯的量逐漸增大，以45%乙醇洗脫液中穿心蓮內(nèi)酯的量和收率最高，隨后，再用55%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液中穿心蓮內(nèi)酯的含量較少，表明采用45%的乙醇洗脫液便可將大部分的穿心蓮內(nèi)酯解吸。因此，選用45%的乙醇作為洗脫劑。

對(duì)吸附后的HPD-100樹脂床，以25%乙醇水溶液洗去與樹脂吸附弱的強(qiáng)極性雜質(zhì)后，采用45%乙醇分別以1 mL/min、0.5 mL/min的體積流量進(jìn)行洗脫，洗脫曲線如圖3所示。

圖3 不同體積流量下45%乙醇溶液的洗脫曲線

由圖3可以看出，以0.5 mL/min的洗脫效果最佳，洗脫峰較集中，拖尾現(xiàn)象不是很明顯。這可能是體積流量對(duì)洗脫劑與吸附在樹脂上的穿心蓮內(nèi)酯間的交換速率進(jìn)行影響所致，體積流量太快，洗脫劑未能與被吸附的內(nèi)酯充分作用而將其從大孔樹脂的吸附位點(diǎn)上置換出來(lái)。當(dāng)洗脫體積流量為0.5 mL/min，洗脫液達(dá)100 mL時(shí)，穿心蓮內(nèi)酯基本洗脫完全。

2.4 乙醇回流提取液與減壓內(nèi)部沸騰提取液純化效果的比較在相同的吸附和解吸條件下，將乙醇回流提取液進(jìn)行上柱，并與減壓內(nèi)部沸騰法進(jìn)行比較，兩者純化效果見表2。

表2 乙醇回流提取液與減壓內(nèi)部沸騰提取液純化效果的比較

由表2可以看出，采用大孔樹脂選擇性吸附，大大提高了穿心蓮內(nèi)酯的純度。其中，減壓內(nèi)部沸騰法制得的提取液經(jīng)純化后，穿心蓮內(nèi)酯的含有量達(dá)72.70%，比醇提法高出15.46%，回收率達(dá)82.89%，也略高于醇提法，其主要原因是回流提取液的色素量比內(nèi)部沸騰提取液高1.55倍，且樹脂吸附后殘留色素也高14.7倍，對(duì)樹脂的吸附及洗脫生產(chǎn)了很大影響。

2.5 同一批樹脂連續(xù)分離效果的比較對(duì)每一批提取液分離后的層析柱采用95%乙醇進(jìn)行簡(jiǎn)單再生，然后按上述確定的吸附洗脫條件，分別取乙醇回流法和減壓內(nèi)部沸騰法的提取液過(guò)柱分離，重復(fù)操作4次，其結(jié)果見表3。

由表3可以看出，樹脂重復(fù)使用后，穿心蓮內(nèi)酯的純度均有所下降，以乙醇回流法的下降速度更快，且樹脂殘留的色素量增加。其中，傳統(tǒng)醇提液上柱的樹脂重復(fù)使用3次后，穿心蓮內(nèi)酯的純度降為50%以下，而減壓內(nèi)部沸騰提取液上柱的樹脂重復(fù)使用4次后，內(nèi)酯的純度仍在50%以上，對(duì)要求控制產(chǎn)品純度大于50%的工藝，采用減壓內(nèi)部沸騰提取液樹脂可以重復(fù)使用4次，而采用乙醇回流提取只能使用2次。

表3 乙醇回流提取液與減壓內(nèi)部沸騰提取液樹脂再生效果的比較

3 討論

3.1 通過(guò)靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)的運(yùn)用，篩選到適用于穿心蓮內(nèi)酯分離純化用的大孔吸附樹脂為HPD-100，并確定了樹脂床體積為60 BV，最佳的純化工藝條件:上柱液體積流量為1 mL/min，上樣量為150 mL，洗脫劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%，洗脫體積流量為0.5 mL/min，洗脫劑用量為100 mL。在此條件下，精制后的穿心蓮內(nèi)酯的純度從初始的11.16%提高到72.70%，比醇提高出15.46%，回收率達(dá)82.89%，也略高于醇提，且樹脂殘留色素較少，樹脂重復(fù)次數(shù)比醇提法提高一倍。

3.2 采用減壓內(nèi)部沸騰法制得的穿心蓮提取液，能有效降低葉綠素等雜質(zhì)的溶出，減少了對(duì)后續(xù)大孔吸附樹脂純化工藝的干擾。減壓內(nèi)部沸騰法提取-大孔樹脂吸附的新工藝提高了產(chǎn)品質(zhì)量，延長(zhǎng)了樹脂的使用壽命，值得推廣。

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