影響小兒清熱利肺口服液中指標成分轉移率的工藝因素研究

馮敬文，盧其福，沈雪梅，龍曉英*，王四元

(1.廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006;2.廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司，廣東廣州511400)

小兒清熱利肺口服液為廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司的名牌產品，由銀翹散和麻杏石甘湯兩個古方化裁而成。該產品為金銀花、連翹、牛蒡子、麻黃等十一味中藥組成的復方制劑［1］，其生產工藝包括水提、醇沉液混合其余分煎藥液后濃縮配劑(以下簡稱濃縮配劑)等流程。鑒于不同批次口服液中活性成分含有量差異較大，因此，探討活性成分的損失原因以及減少其損失的方法是該產品亟待研究的重要課題。本實驗以方中君藥與臣藥中的活性成分(綠原酸、連翹苷、牛蒡子苷和鹽酸麻黃堿)為考察指標，對這些成分在各工藝點的轉移率進行跟蹤，并對藥液中的鞣質與總固形物進行定量分析。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀(LC-20A日本島津);紫外分光光度儀(UV-2450日本島津);十萬分之一電子天平(Satorius BP211D);恒溫水浴鍋(HH-6宏華新佳)。

1.2 試劑與試藥綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413)，鹽酸麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號171241-200404)，連翹苷(中國藥品生物制品檢定所，批號:11084-200711)，牛蒡子苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110819-200404);水質濁度標準物質(中國計量科學研究院);乙腈(色譜純，迪馬公司)，鉻皮粉(分析純，上海邁坤化工公司)，磷酸(分析純)，甲醇(分析純)，三乙銨(分析純)。

小兒清熱利肺口服液(廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司，批號:I10001、I05001A、J05001A，以下簡稱“清利口服液”)。

2 方法與結果

2.1 指標成分測定采用高效液相色譜法測定藥液中綠原酸、鹽酸麻黃堿、連翹苷與牛蒡子苷［2-4］，具體色譜條件:DiamonsiL TM C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm);體積流量1 mL/min。①檢測綠原酸的流動相為乙腈－0.4%磷酸水溶液(10∶90);波長327 nm;柱溫30℃。②檢測鹽酸麻黃堿的流動相乙腈－0.1%磷酸(5∶95，含0.1%三乙胺);波長207 nm;柱溫25℃。③檢測連翹苷與牛蒡子苷的流動相乙腈－0.02%磷酸溶液(23∶77);波長228 nm;柱溫30℃。

2.2 鞣質定量測定-重量法鞣質為水溶性物質，鉻皮粉含部分水溶性物質，并可選擇性與鞣質結合生成沉淀，分別測定供試藥液中的總水溶性部分、不與皮粉結合的水溶性部分和皮粉的水溶性部分，即可求得鞣質質量［5］。精密吸取醇沉上清液5 mL，用蒸餾水稀釋至125 mL作為供試溶液進行測定。

2.3 固體物定量測定精密吸取藥液10 mL，按《中國藥典》2010年版附錄XA規(guī)定的浸出物測定法測定藥液中總固體物含量。

2.4 工藝過程指標成分轉移率跟蹤實驗清利口服液工藝流程主要包括提取、濃縮、醇沉、收醇濃縮、醇沉液混合其余分煎藥液后濃縮配劑(以下簡稱濃縮配劑)、低溫冷藏、最終調配封裝7個工序。本實驗以綠原酸、鹽酸麻黃堿、連翹苷及牛蒡子苷4個活性成分轉移率為跟蹤目標(轉移率均以藥材中的含量為100%計算)，對兩個批次(I05001A、J05001A)產品進行工藝跟蹤。實驗發(fā)現，牛蒡子中也含有綠原酸。因此，口服液中的綠原酸為金銀花與牛蒡子中綠原酸的含有量之和。各指標成分于關鍵工藝工程的轉移率結果見圖1。

圖1數據顯示，在提取、醇沉及濃縮配劑工藝過程三步工藝，4種活性成分轉移率顯著降低，綠原酸、連翹苷與牛蒡子苷的提取率僅為50%左右，同時，在提取工藝中，不同批次的提取率也有差異，因此，本實驗對這3個關鍵工藝的成分轉移率開展了進一步實驗研究。

2.5 工藝因素對指標成分的影響為進一步了解各工藝因素對4個活性成分轉移率的影響，對提取溫度與時間、濃縮時間以及醇沉條件等工藝因素對指標成分的轉移率進行單因素考察，實驗均平行重復三組，取平均值。將大生產中提取所用的溫度與時間及濃縮時間(體積)均設計在單因素考察的范圍內。

2.5.1 提取溫度的影響稱取適量藥材，加入規(guī)定量水，分別于50、60、70、80、90、100℃的條件下單獨回流提取1 h，提取液按2.1項方法測定各指標成分，以溫度為橫坐標，藥材的轉移率(轉移率均以投料總藥材中的含有量為100%計算)為縱坐標繪制轉移率-溫度關系曲線。結果見圖2。

圖2 溫度與各藥材的轉移率關系(n=3)

2.5.2 提取時間的影響稱取藥材適量，加入規(guī)定量水在100℃條件下單獨回流提取，以開始沸騰時為零時刻，分別于20、60、80、100、120 min取樣，樣品按2.1項方法測定各指標成分，以時間為橫坐標，藥材的轉移率(轉移率均以投料總藥材中的含有量為100%計算)為縱坐標繪制轉移率-時間關系曲線。結果見圖3。

圖2，圖3顯示，金銀花最佳提取溫度為80℃，最佳提取時間約為75 min，牛蒡子中綠原酸量隨著溫度升高與時間延長而增加，綠原酸在大于60℃時遞增幅度加大，在110 min左右變化趨勢變緩。麻黃中的鹽酸麻黃堿量與溫度和時間呈正比的遞增關系，提取溫度高于70℃時，其含有量隨溫度顯著遞增。圖2顯示，提取溫度90℃時連翹苷量最高，繼續(xù)升高溫度，含有量變化不明顯;牛蒡子水提液中牛蒡子苷量隨溫度升高而增加。圖3表明，提取時間約60 min藥液中連翹苷量高，延長提取時間，連翹苷量遞減;牛蒡子的最佳提取時間在100 min左右，之后隨時間增加含有量降低。

圖3 提取時間與各藥材的轉移率關系(n=3)

實驗結果顯示，不同成分有各自的最佳提取溫度與時間。總體來看，溫度低，提取不完全，溫度在100℃內，隨溫度升高，提取率增加;提取時間延長到一定程度，提取量反而減少。綜合考慮，確定最佳提取溫度在100℃，提取時間控制在60～75 min內。

2.5.3 濃縮時間的影響為進一步說明長時間的濃縮對指標成分的影響，因此取混合藥材提取液3 000 mL于100℃進行濃縮，分別在不同濃縮時間取樣(濃縮時間以本制劑水提液濃縮倍數為限度)，另取各指標成分的標準品配制成已知濃度的溶液，保持溶液體積不變情況下濃縮相等時間，樣品按2.1項方法測定，以時間為橫坐標，轉移率(轉移率均以初始總溶液中的含有量為100%計算)為縱坐標繪制轉移率-溫度關系曲線。實驗結果見圖4。

圖4 提取液濃縮時間與各藥材的轉移率關系(n=3)

圖4顯示，水提液在濃縮過程中，藥液中各指標成分含有量降低并不明顯，且這種變化趨勢與各對照品溶液在濃縮過程中的變化趨勢是相似的。說明各指標成分在濃縮過程中是比較穩(wěn)定的，濃縮工藝并不是造成活性成分損失的主要原因，在工藝標準下的濃縮體積并不會造成指標成分溶解度降低而析出。

2.5.4 醇沉條件的影響清熱利肺口服液的生產工藝中明確規(guī)定了醇沉工藝參數包括乙醇體積分數、醇沉次數與放置時間，但是大生產發(fā)現，醇沉過程中攪拌方式的不同也可能造成指標成分含有量的差異。因此，本實驗對攪拌方式進行考察。

取批次J05001A濃縮液(相對密度為1.171 8)，按生產工藝規(guī)定的醇沉濃度、次數及時間在實驗室進行醇沉操作，以上清液中各指標成分轉移率(轉移率以各成分在濃縮液中的含有量為100%計算)，并以鞣質和固形物的去除率為指標評價醇沉效果。將實驗室實驗結果與大生產樣品測得結果進行對比。結果見表1～2。

大生產的醇沉操作為邊加乙醇邊進行攪拌，待全部乙醇加入后繼續(xù)攪拌0.5 h，即可靜置沉降，靜置沉降過程中不再攪拌。實驗室醇沉的攪拌方式與大生產略有不同。見表1～2。數據表明，在靜置沉降過程中加以攪拌可明顯減少各指標成分的損失。

表1 大生產醇沉結果(靜置沉降過程中不攪拌)

表2 實驗室醇沉結果(n=3)

2.5.5 濃縮配劑工藝的影響此濃縮配劑工藝過程主要是收醇濃縮液混合其它分煎液體后進行濃縮，所得最終濃縮液再與另外分煎液配劑。在此過程中，最終濃縮液因為后續(xù)配劑時間的延長而使其出現了大量黑色沉淀物，另外后續(xù)配劑只使用最終濃縮液的上層液。

通過對此工藝過程產生的沉淀進行溶解度分析，沉淀溶解于酸液，并且前工藝經過60%醇沉，綜合考慮，推測為鞣質。因此對最終濃縮液上層液體和沉淀進行鞣質的測定，結果顯示上層液中鞣質質量為38.88 mg/mL、沉淀中的百分比為79.76%。測定新鮮制得與放置2 d后的最終濃縮液中鹽酸麻黃堿、連翹苷、牛蒡子苷和綠原酸含量，其轉移率(轉移率以有效成分在新鮮的最終濃縮液的量為100%計算)分別為81.68%、73.22%、83.37%和83.02%。

3 討論

本實驗針對影響指標成分轉移率的三個主要工藝因素的研究表明，提取的工藝條件為100℃、60 min時各指標成分應有較高的轉移率，但實際生產跟蹤結果可得知各指標成分顯著偏低，而且批之間存在差異，這可能與合煎過程中，特別是大生產藥材處于靜止狀態(tài)，成分提取不完全、或提取過程中發(fā)生成分之間(小分子之間、小分子與大分子之間)的相互作用形成沉淀，或成分吸附于藥渣等因素有關。

而醇沉工藝，在明確醇沉濃度，次數及時間的基礎上，醇沉過程充分攪拌對指標成分轉移率影響較大，因為，醇沉主要去除大分子雜質(蛋白、淀粉、鞣質等)，但大分子雜質在沉淀過程中，如攪拌不勻，將造成局部含醇量過高，淀粉、蛋白質類成分可吸附、包裹部分有效成分共同形成沉淀［6-7］，引起成分損失，但如果沉淀過程中增加攪拌，可使被包裹的有效成分重新分散于醇溶液中，增加有效成分的保留率。因為平衡實驗條件下，指標成分綠原酸、連翹苷、牛蒡子苷與鹽酸麻黃堿在60%乙醇(工藝醇沉濃度)中的溶解度分別是在水中2.9、5.7、4.5、1.3倍，所以推測醇沉時有效成分被雜質成分吸附包裹而損失。

結合2.5.3項實驗結果我們認為，導致濃縮配劑工藝過程中活性成分顯著損失的主要原因并不是濃縮工藝。在生產跟蹤過程中發(fā)現，濃縮配制工藝中的最終濃縮液由于工藝的銜接怠慢，導致靜置沉降中會產生大量黑色沉淀，靜置時間越長沉淀物越多，上層藥液中的活性成分含有量越低。經分析此黑色沉淀主要成分為鞣質。因此，分析成分損失的原因可能與濃縮液里含有的鞣質有關。高濃度的鞣質與活性成分結合或自身聚合包裹活性成分自藥液中沉降出來，也是導致成分損失的一個重要原因。

本研究基于對產品的生產過程進行跟蹤考察，探討了小兒清熱利肺口服液生產過程中質量的動態(tài)變化情況，研究結果對提高復方中藥口服液的質量提供了實驗依據，具有一定的參考價值。

［1］易明娟，謝子清，譚億明，等.清熱利肺口服液的藥理研究［J］.成都中醫(yī)藥大學學報，1997，20(4):35-39.

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［5］時鈞，袁權，高從增.膜技術手冊［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2001:137-17.

［6］陳健岳，陳健姿.中藥口服液制備工藝中應注意的問題［J］.時珍國醫(yī)國藥，2004，15(5):274.

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