華法林個(gè)體化用藥的研究進(jìn)展

葛蓓蕾 田陸云 王 紅 (昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032)

華法林(warfarin)是20世紀(jì)40年代合成的香豆素類口服抗凝血藥，目前被廣泛應(yīng)用于多種疾病的抗凝治療，如瓣膜病、瓣膜置換、非瓣膜病性房顫、電復(fù)律、冠心病、肺栓塞和深靜脈血栓形成等〔1〕。但華法林治療范圍窄，臨床療效和不良反應(yīng)個(gè)體差異很大，劑量很難掌握，即使很小的劑量也可能會(huì)導(dǎo)致出血，抗凝不足又會(huì)導(dǎo)致血栓的形成。因而限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，基因多態(tài)性的研究給華法林臨床個(gè)體化用藥帶來希望。

目前對(duì)華法林個(gè)體劑量差異相關(guān)基因的研究大致從以下兩類著手:一類是影響藥物代謝動(dòng)力學(xué)，編碼藥物代謝酶和負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，如細(xì)胞色素氧化酶P450(CYP)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子等;一類是影響藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)，編碼藥物作用的靶點(diǎn)、血漿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的基因，如 VKORC1、載脂蛋白E、γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)、微粒體環(huán)氧化物水解酶(mEH)等。

1 華法林的藥物代謝

華法林在體內(nèi)是被不同的CYP同工酶通過羧基化而代謝成非活性產(chǎn)物的。臨床上所用的華法林制劑為消旋混合物，為S-華法林對(duì)映體和R-華法林對(duì)映體混合物。不同類型的華法林對(duì)映體代謝酶、代謝產(chǎn)物也不同。S-華法林對(duì)映體經(jīng)CYP2C9酶催化生成無活性6-7羥華法林;而R-華法林對(duì)映體則由 CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4 酶代謝〔2〕。其中 CYP3A4 將R-華法林催化生成無10-羥華法林，此為R-華法林代謝的主要成分。S-華法林其抗凝活性是R-華法林的3～5倍〔3〕。由此可以看出CYP2C9是影響華法林代謝的主要酶之一。

1.1 CYP2C9多態(tài)性及等位基因的突變頻率 細(xì)胞色素P450(CYP450)是參與許多內(nèi)外源性物質(zhì)代謝的單加氧酶，位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，由 CYP基因超家族編碼。最大的家族是CYP2〔4〕，目 前 已 經(jīng) 分 離 出 CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2C17、CYP2C18及CYP2C19。其中CYP2C9基因編碼的蛋白在人肝微粒體中含量豐富，約占CYP450總量的20%，僅次于CYP3A，催化了約16%〔5〕的臨床常用藥物。

大量研究表明CYP2C9在人類存在幾種等位基因突變體，其中最主要的有3種:野生型 CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3。突變體是CYP2C9*2和CYP2C9*3，其編碼的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了30%和80%〔6〕，CYP活性降低的患者，華法林在體內(nèi)代謝速度減慢，導(dǎo)致有效血藥濃度升高，進(jìn)而使藥物療效增強(qiáng)。因此CYP2C9基因突變體需要華法林劑量較低。攜帶這兩個(gè)等位基因的個(gè)體服用華法林后需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，并且在使用初期出血危險(xiǎn)性較高。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因頻率有較大的種族差異。白種人中突變發(fā)生率高于黃種人和黑人，在白種人中CYP2C9*2型突變率在10%以上，意大利人達(dá)到12.5%，亞洲人中這種突變率非常低。CYP2C9*3型突變?cè)诎追N人中發(fā)生率在7.5% ～10%，亞洲人中約 3%〔7〕。其他突變?nèi)?CYP2C9*4，CYP2C9*5，CYP2C9*6 以及 CYP2C9*11等在人群中突變頻率很低，華法林劑量的影響還有待于研究〔8〕。

1.2 CYP2C9 多態(tài)性與華法林劑量 Kamali等〔9〕報(bào)道CYP2C9基因多態(tài)性會(huì)影響華法林的劑量，如純合子(*1/*1，n=74)所需劑量為(4.06±1.72)mg，雜合子(*1/*2，n=30)為(3.63±1.78)mg，雜合子 (*1/*3，n=15)為(2.70±1.36)mg。Sanderson等〔10〕在 CYP2C9 與華法林多態(tài)性的研究中指出有20%的病人有等位基因變異，CYP2C9*2型平均日華法林劑量減少了0.85 mg，CYP2C9*3型減少了1.92 mg，CYP2C9的基因型在華法林的臨床應(yīng)用中有很大的意義。中國人華法林代謝主要與CYP2C9*1和CYP2C9*3有關(guān)，馬量等〔11〕報(bào)道CYP2C9.Leu359基因變異與華法林并發(fā)癥的關(guān)系。報(bào)道表明CYP2C911e.359 Leu 359的突變會(huì)減慢S-華法林的代謝，攜帶該突變的病人容易出現(xiàn)出血等并發(fā)癥，此類病人應(yīng)用華法林的劑量要小。華人華法林維持劑量比印度人低，在印度的華人，除CYP2C9*3突變體外，還發(fā)現(xiàn)了更多的變異，如在CYP2C9啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子也發(fā)現(xiàn)了突變〔12〕。

2 華法林的作用機(jī)制

華法林通過抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶，阻止維生素 K還原形式(KH2)的形成。KH2通過對(duì)維生素K依賴性凝血因子 Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ氨基末端谷氨酸殘基的γ-羧化作用，使其具有生物活性。在羧化形成過程中，耦聯(lián)氫醌型維生素K被氧化成環(huán)氧型維生素K。使維生素K依賴性凝血因子前體被持續(xù)羧化成有活性的凝血因子。體內(nèi)環(huán)氧型維生素K還原為氫醌型維生素K由維生素環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體(VKORC)完成，VKORC是維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶〔13〕，同時(shí)VKORC由VKORC1激活。VKORC1不但主導(dǎo)維生素K依賴性凝血因子的生成，而且是香豆素類抗凝藥物華法林的作用靶點(diǎn)〔14〕。目前，對(duì)華法林作用機(jī)制影響的基因研究熱點(diǎn)集中在VKORC1。

2.1 VKORC1基因多態(tài)性與等位基因頻率 VKORC1位于16號(hào)染色體上，其產(chǎn)物維生素K環(huán)氧化物還原酶亞單位1，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。很多研究顯示VKORC1基因多態(tài)性比CYP2C9基因多態(tài)性更能顯示華法林個(gè)體劑量差異，它不但可以解釋華法林的個(gè)體差異還可以解釋種族差異。目前對(duì)VKORC1多態(tài)性的研究集中在啟動(dòng)子-1639A/G，內(nèi)含子1173C＞T和3'非編碼區(qū)的3730G＞A。

臺(tái)灣學(xué)者Yuan等〔14〕一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)-1639A＞G多態(tài)性與華法林劑量有關(guān)。AA，AG，GG3種基因型在中國患者中的分布頻率分別為:79.7%、17.6%及2.7%，對(duì)華法林敏感的均為-1639AA基因型，對(duì)華法林抵抗的與-1639GG和GA基因型相關(guān)。而在白種人中分別為:14%、47%及39%。這兩種人種中AA基因型頻率的差異與臨床上發(fā)現(xiàn)的華法林維持劑量差異相一致。Lee研究〔15〕指出，在中國，馬來西亞和印度人中華法林需求劑量的不同可以用民族間VKORC1基因型的不同來解釋。VKORC1基因序列上存在10種基因突變，據(jù)此命名為H1～H9的單倍體模型，發(fā)現(xiàn)H1突變與華法林劑量減少有關(guān)，而H7、H8、H9突變與華法林劑量增加有關(guān)。H1突變?cè)谥袊?、馬來西亞人分別占87%、65%，在印度人中占12%。H7、H8、H9突變?cè)谥袊?、馬來西亞人分別占9%和30%，而印度人占82%，這三者和華法林的劑量差異相符。

2.2 VKORC1基因多態(tài)性與華法林劑量 D'Andrea等〔16〕提出兩個(gè)常見的多態(tài)現(xiàn)象，即位于內(nèi)含子1的1173C＞T和3'非編碼區(qū)的3730G＞A能影響華法林個(gè)體劑量。在不考慮其他變異存在的情況下，1173CC基因型華法林劑量(6.2 mg/d)比CT或者TT基因型(4.8 mg/d)高。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)含子區(qū)的1173C＞T的突變與VKORC1-1639A/G突變存在著強(qiáng)烈的連鎖不平衡效應(yīng)，對(duì)華法林敏感的-1639AA基因型同時(shí)也是1173TT純合子的基因型，對(duì)華法林抵抗的-1639AG同時(shí)也是1173TC基因型，-1639GG也與1173CC連鎖。1639G＞A啟動(dòng)子還與 6484C＞T(rs9934438)，6853G＞C(rs8050894)和7566C＞T(rS2359612)有很明顯的連鎖不平衡〔17〕。

臺(tái)灣學(xué)者Yuan等〔14〕的研究顯示在要達(dá)到相同抗凝強(qiáng)度時(shí)，華法林劑量也就隨著基因型的不同而出現(xiàn)了差異，-1639AA基因型對(duì)華法林敏感，華法林需求劑量≤1.5 mg/d，而-1639AG或者-1639GG對(duì)華法林抵抗，華法林需求劑量≥6.0 mg/d。他們推斷這是由于VKORC1-1639A/G變異導(dǎo)致該啟動(dòng)子活性不同，VKORC1 mRNA表達(dá)量不同，引起VKORC1蛋白量不同，進(jìn)而導(dǎo)致華法林個(gè)體劑量差異。

3 其他多態(tài)性與華法林劑量之間的關(guān)系

載脂蛋白E(ApoE)基因共有4個(gè)外顯子，其產(chǎn)物主要在肝臟和小腸合成。ApoE存在于乳糜微粒殘粒中，并在其代謝過程中作為受體與配體結(jié)合，協(xié)助VitK轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟〔18〕。ApoE最主要的3個(gè)表型E2、E3和E4相對(duì)應(yīng)的是4號(hào)外顯子的3種基因型，分別為2、3、4。不同的等位基因變異對(duì)華法林劑量的影響取決于它們?cè)谶@個(gè)人群中的突變頻率，這受種族的影響。例如ε4基因型對(duì)華法林需求劑量影響很小，臨床相關(guān)性小，在亞洲人群中其基因型頻率比高加索人和美國人要低〔19〕。多變量回歸分析顯示在抗凝治療人群中，病人的年齡、體重、CYP2C9、VKORC1、APOE基因的多態(tài)性可以顯著預(yù)測(cè)華法林劑量(R=57%)。但是ε4基因僅能解釋2%華法林個(gè)體劑量差異。

γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因有15個(gè)外顯子，其基因產(chǎn)物GGCX蛋白是一種微粒體膜酶，存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上。GGCX催化VitK依賴的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，以及蛋白C和S的谷氨酸殘基翻譯后的γ-羧化，此羧化過程與隨后進(jìn)行的還原型VitK氧化過程相耦聯(lián)，氧化型VitK又被VKORC1所還原。Wadelius等〔20〕研究了GGCX基因的14個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，發(fā)現(xiàn)位于2號(hào)內(nèi)含子的SNP與華法林的劑量密切相關(guān)，其他單倍型與華法林的劑量無明顯相關(guān)性。另外有研究顯示〔21〕，VKORC1基因多態(tài)性顯著影響華法林個(gè)體劑量，CYP2C9*3、*2中等程度的影響華法林個(gè)體劑量。其他基因無影響或僅有很小的影響，這些基因包括編碼GGCX，各種凝血因子、環(huán)氧化物水解酶(mEH)、CYP的各種亞型，某些谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、APOE、蛋白C。至于CYP4F2，意義很小，CYP4F2突變的病人華法林劑量約增加0.5 mg/d。作者指出除了CYP2C9和VKORC1，其他常見的單核苷酸基因多態(tài)性很少影響華法林的個(gè)體劑量。因此有關(guān)此兩個(gè)基因有待進(jìn)一步研究。

4 基因型和抗凝反應(yīng)之間的聯(lián)系

華法林的代謝受很多病理、生理和環(huán)境因素的影響，但多項(xiàng)研究顯示:遺傳因素在華法林個(gè)體反應(yīng)差異中起決定性的作用。華法林在起始治療時(shí)常會(huì)出現(xiàn)過度抗凝，尤其是老年人，隨著年齡的增長(zhǎng)，肝臟合成凝血因子能力減退，VitK的攝入與吸收減少;CyP450酶含量及活性下降;同時(shí)由于并存疾病及合并用藥，出血傾向明顯，華法林的劑量應(yīng)相應(yīng)減少。一項(xiàng)研究表明〔22〕攜帶CYP2C9突變體的病人，INR值高于治療范圍的比率較高，需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到維持劑量，危及生命的出血風(fēng)險(xiǎn)率較野生型高。另一項(xiàng)研究證明〔23〕，CYP2C9*2或者CYP2C9*3雜合子和純合子與野生型相比華法林劑量低，過度抗凝導(dǎo)致出血的風(fēng)險(xiǎn)率增加。由此我們認(rèn)識(shí)到基因型與嚴(yán)重出血有關(guān)，我們應(yīng)關(guān)注基因型和其他因素對(duì)華法林個(gè)體差異的影響，從而進(jìn)行更有針對(duì)性的個(gè)體化治療。

Sconce等〔24〕通過對(duì)年齡、體重、CYP2C9 和 VKORC1基因型變量進(jìn)行分析，可以解釋55%華法林需求劑量的差異。一項(xiàng)瑞典人的研究顯示〔25〕，在起始治療時(shí)，純合子的 CYP2C9和VKORC1等位基因突變會(huì)增加過度抗凝的風(fēng)險(xiǎn)。CYP2C9、VKORC1、年齡、性別、藥物間相互作用的多重回歸分析可以解釋59%的華法林個(gè)體劑量差異。非遺傳因素可以解釋17%～22%的劑量差異。CYP2C99，VKORC1 CC，VKORC1 TC聯(lián)合年齡體重可以解釋亞洲人60.2%的華法林劑量差異〔26〕。

華法林的臨床個(gè)體用藥差異是由多種因素決定的，除了基因影響華法林劑量差異外，環(huán)境、飲食也是華法林個(gè)體劑量差異的因素。盡管CYP2C9、VKORC1、臨床和病人因素不能完全解釋華法林劑量需求的個(gè)體差異，但很多研究顯示通過CYP2C9、VKORC1基因型劑量方程的建立仍然可以提高華法林劑量的準(zhǔn)確性，減少經(jīng)驗(yàn)性用藥所帶來抗凝不足或過度抗凝的風(fēng)險(xiǎn)，提高個(gè)體抗凝治療安全性。未來遺傳藥理學(xué)的臨床應(yīng)用要求藥物劑量與遺傳學(xué)、臨床和病人因素結(jié)合起來，以更好地指導(dǎo)個(gè)體化用藥，從而使臨床用藥更具針對(duì)性、高效性和安全性。

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