CD133陰性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀☆

黃寧陳松程遠(yuǎn)

CD133陰性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀☆

黃寧*陳松*程遠(yuǎn)*

膠質(zhì)瘤 腫瘤干細(xì)胞 CD133 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）假說(shuō)認(rèn)為：腫瘤中存在一組特殊的細(xì)胞亞群，雖然它們所占比例極小，但卻是腫瘤無(wú)限增殖、高侵襲及多藥耐藥的源泉。CSCs的分離和生物學(xué)特征的驗(yàn)證對(duì)腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的觀念產(chǎn)生了重大影響。目前已在白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤中分離并證實(shí)了CSCs的存在。在膠質(zhì)瘤中已分離出CD133（＋）腫瘤細(xì)胞，它們類似于神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs），具有很強(qiáng)的自我更新能力，能夠形成腫瘤球，并在NOD／SCID鼠的原位種植中成瘤。CD133作為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）標(biāo)記物的觀點(diǎn)已被接受，但近年來(lái)研究證實(shí)有一小群CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞也具有干細(xì)胞特征，動(dòng)搖了CD133作為檢驗(yàn)GSCs“標(biāo)準(zhǔn)”的地位。本文將對(duì)CD133（－）GSCs存在依據(jù)、與CD133（＋）GSCs相互關(guān)系、CD133（－）GSCs探索的局限性以及CD133（－）GSCs標(biāo)志物研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CD133（－）GSCs存在依據(jù)

“腫瘤球”、多潛能分化、單細(xì)胞克隆、致瘤性及干細(xì)胞標(biāo)記物已成為了鑒定CSCs的必備條件，然而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中存在具有上述特點(diǎn)的CD133（－）細(xì)胞亞群。

1.1 形態(tài)學(xué) NSCs或CD133（＋）GSCs的生長(zhǎng)方式均為“球形聚集”。在膠質(zhì)瘤中用流式細(xì)胞技術(shù)或免疫磁珠分選出CD133（＋）細(xì)胞后，剩余的CD133（－）腫瘤細(xì)胞仍可形成“腫瘤球”［1］；此外在部分原代膠質(zhì)瘤中無(wú)法檢測(cè)到CD133（＋）腫瘤細(xì)胞，而0.5%～2%的 CD133（－）腫瘤細(xì)胞也能聚集成球形生長(zhǎng)［2］，但大量的膠質(zhì)瘤細(xì)胞卻不具備干細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)。

1.2 多潛能分化 聚集成球的CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞在自然狀態(tài)下無(wú)神經(jīng)系三系標(biāo)記物的表達(dá)，但進(jìn)行分化誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)其可獲得表達(dá)GaIC、GFAP、MAP2的能力，證明它們較為原始，擁有分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的趨勢(shì)［2－3］，且可形成分化較為成熟的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

1.3 自我更新 單個(gè)孤立的GSCs具有克隆能力并逐漸形成“球形聚集”。把聚集成球的CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞稀釋成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)：16.9%～53.8%能夠形成克隆并重新形成腫瘤球，與CD133（＋）GSCs比較無(wú)顯著差異［3］。這些具有克隆能力的CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞在形成“腫瘤球”的過(guò)程中還可產(chǎn)生大量貼壁的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，而再次將貼壁細(xì)胞稀釋成單個(gè)細(xì)胞后卻失去了克隆能力。

1.4 致瘤性 致瘤性是CSCs的一大特點(diǎn)，在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)一部分“聚集成球”、多潛能分化、自我更新的CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞也存在極強(qiáng)致瘤性， 只需要105～106該細(xì)胞就能在NOD／SCID鼠同位種植中成瘤［2－3］，其表型與原發(fā)腫瘤相似，出現(xiàn)胞核多形性、細(xì)胞過(guò)度分裂、組織壞死、微血管大量增生等，通過(guò)MRI檢測(cè)顯示其形態(tài)、大小和成瘤時(shí)間都與CD133（＋）GSCs所形成的腫瘤無(wú)顯著差異［4－5］，但普通的膠質(zhì)瘤細(xì)胞卻不具備致瘤性［6］。

1.5 干細(xì)胞標(biāo)記物 目前鑒定GSCs最常用的方法之一為使用干細(xì)胞標(biāo)記物，而具備上述幾種特征的CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞亦表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin［7］。

1.6 其他 在同一腫瘤組織中的不同區(qū)域往往存在組織或細(xì)胞學(xué)上的差別［8］，例如：細(xì)胞形態(tài)、血管密度、降解周圍基底膜的能力、染色體核型分析、分子表型、信號(hào)通路、端粒和端粒酶的分析。同時(shí)CD133的表達(dá)也出現(xiàn)區(qū)域性差異，這一現(xiàn)象說(shuō)明整個(gè)腫瘤組織可能起源于不同的遺傳背景。Lottaz等［9］的研究證實(shí)極少部分CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞與NSCs存在相似的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，尤其在抗凋亡中利用了相似通路，但大部分CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞卻無(wú)類似的分子機(jī)制。

綜上所述CD133（－）GSCs已逐漸被證實(shí)，它們?cè)诒３肿晕腋碌耐瑫r(shí)能產(chǎn)生大量子代CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞，而這些子代膠質(zhì)瘤細(xì)胞卻失去了CSCs的特征。

2 CD133（＋）和CD133（－）GSCs的關(guān)系

目前的研究已證實(shí)CD133（－）GSCs的存在，但它們和CD133（＋）GSCs之間的相互關(guān)系一直是頗受爭(zhēng)議的話題。有研究表明：①CD133（＋）GSCs的腫瘤和干細(xì)胞特征都明顯強(qiáng)于CD133（－）GSCs，且CD133（＋）GSCs能夠產(chǎn)生CD133（－）腫瘤細(xì)胞，所以CD133（＋）GSCs才是最為原始的膠質(zhì)瘤起源因素；②CD133（＋）GSCs與CD133（－）GSCs相比端粒酶活性更強(qiáng)，在連續(xù)增殖過(guò)程中 CD133（－）GSCs的端?？s短更為顯著［10］。但值得關(guān)注的是由CD133（＋）GSCs產(chǎn)生的大部分CD133（－）腫瘤細(xì)胞卻并不具備 CD133（－）GSCs的生物學(xué)性質(zhì)［2］，因此這樣的CD133（－）腫瘤細(xì)胞本質(zhì)上與CD133（－）GSCs存在顯著差異，同時(shí)也對(duì)“CD133（＋）腫瘤細(xì)胞才是膠質(zhì)瘤唯一起源”這一學(xué)說(shuō)產(chǎn)生質(zhì)疑。

CD133（－）GSCs亦有可能是最為原始的腫瘤細(xì)胞：①CD133（＋）GSCs大多處于細(xì)胞周期S期、G2期和M期，但CD133（－）GSCs主要處于G0／G1期，即休眠狀態(tài)，而這種靜止?fàn)顟B(tài)更符合最原始干細(xì)胞慢周期的特點(diǎn)［11］；②在多個(gè)原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)CD133（＋）表達(dá)，但在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下仍能產(chǎn)生“腫瘤球”，并在同位種植中再次出現(xiàn)與其原代腫瘤病理學(xué)特征相似的組織。Wang等［4］發(fā)現(xiàn)在這些起源于CD133（－）腫瘤細(xì)胞的新生腫瘤組織中出現(xiàn)了CD133的表達(dá)，說(shuō)明一部分CD133（－）GSCs能夠通過(guò)不對(duì)稱分裂產(chǎn)生子代 CD133（＋）GSCs或自身轉(zhuǎn)化成了CD133（＋）GSCs；③當(dāng)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)缺氧或線粒體功能障礙時(shí)可促進(jìn)CD133表達(dá)［12］，這也極其符合一部分CD133（－）腫瘤細(xì)胞能夠在演變中產(chǎn)生CD133（＋）腫瘤細(xì)胞的觀點(diǎn)，因此CD133可能只是在微環(huán)境的誘導(dǎo)下出現(xiàn)的一種分子表型，而并不具備純化CSCs的能力。

上述兩種觀點(diǎn)雖然在“兩種表型的GSCs誰(shuí)產(chǎn)生誰(shuí)”的爭(zhēng)論中出現(xiàn)了矛盾，但卻得到了“兩類GSCs之間可以相互轉(zhuǎn)化”的共識(shí)。但近年來(lái)還有證據(jù)支持CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs是兩種獨(dú)立、起源不同CSCs類型的觀點(diǎn)：①雖然起源不同的膠質(zhì)瘤其病理學(xué)形態(tài)相似，但是不同腫瘤之間的生長(zhǎng)和預(yù)后差異性很大。有臨床報(bào)道顯示：源于CD133（－）GSCs的膠質(zhì)瘤更容易發(fā)生在腦組織深部，且惡性程度更高［5］。②雖然它們都能形成“腫瘤球”，但其形態(tài)有差別。Beier等［2］發(fā)現(xiàn)CD133（＋）GSCs通常形成一個(gè)懸浮、孤立的“球形聚集”，CD133（－）GSCs卻形成一個(gè)部分貼壁或完全貼壁的“腫瘤球”。③兩者中與腫瘤性相關(guān)的 117個(gè)基因的表達(dá)也存在明顯差異［2］。Lottaz［9］還發(fā)現(xiàn)CD133（＋）GSCs與胚胎NSCs轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相似，但CD133（－）GSCs卻與成人 NSCs轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更為接近，而成年NSCs和胚胎NSC之間在轉(zhuǎn)錄物之間卻具有很大差別，如在成人NSCs中CD44和EGFR明顯高于胚胎NSCs，而CD133較胚胎NSCs明顯下調(diào)。

目前的研究并不能明確CD133（＋） GSCs和CD133（－）GSCs之間的相互關(guān)系。更深層的探索發(fā)現(xiàn)［13］，可以把目前所認(rèn)識(shí)的兩類GSCs再次細(xì)分為三類：Ⅰ型為CD133（－）GSCs，它可以分裂成CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；Ⅱ型為CD133（＋）GSCs，它也能產(chǎn)生CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；Ⅲ型為CD133（－）GSCs，但它只能產(chǎn)生CD133（－）的子代腫瘤細(xì)胞，并且子代腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、成瘤、耐藥能力明顯降低。這使得GSCs起源及不同表型GSCs之間相互關(guān)系更加復(fù)雜。

3 檢測(cè)CD133（－）GSCs的局限性

CD133又名Prominin-1，是一種五次跨膜蛋白，分子量為120kD，因其在幼稚細(xì)胞中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)并隨細(xì)胞分化成熟而表達(dá)降低以至消失，被認(rèn)為是干細(xì)胞標(biāo)志物。單克隆抗體的使用能夠檢測(cè)靶蛋白存在及含量，但目前的CD133抗體，如：AC133、AC141、293C等都是通過(guò)檢測(cè)CD133表面一個(gè)特殊的糖基化表位來(lái)驗(yàn)證該蛋白的存在。根據(jù)抗體的檢測(cè)特點(diǎn)，細(xì)胞分化過(guò)程中CD133的變化應(yīng)理解為：隨著干細(xì)胞分化，其糖基化表位逐漸減少而并非整個(gè)CD133蛋白［14］。以往通過(guò)免疫組織／細(xì)胞化學(xué)來(lái)研究CD133作為GSCs標(biāo)志物時(shí)其精確定義為：CD133糖基化表位陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞為GSCs。因此探索CD133（－）GSCs除了要考慮該細(xì)胞原本就不存在CD133蛋白之外，在應(yīng)用CD133抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)還有許多 “由于CD133蛋白存在但無(wú)該糖基化表位”而出現(xiàn)的誤導(dǎo)因素需要考慮：①在某些CD133蛋白表面無(wú)該表位或存在該表位但未糖基化，將檢測(cè)不到CD133蛋白的存在。②腫瘤細(xì)胞較其它細(xì)胞更活躍，可能由于基因突變、微環(huán)境改變、信號(hào)通路異常等對(duì)CD133糖基化表位產(chǎn)生影響。③CD133蛋白的多種剪切變體可受甲基化調(diào)節(jié)，這使得每種變體不一定都存在其特異的糖基化表位而被CD133抗體識(shí)別［15］。④培養(yǎng)細(xì)胞使用的胰酶會(huì)對(duì)細(xì)胞膜蛋白氨基酸序列中多個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行切割，可能將影響CD133糖基化表位。⑤在對(duì)CD133（－）膠質(zhì)瘤組織／細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行CD133 mRNA和蛋白檢測(cè)時(shí)可發(fā)現(xiàn)CD133mRNA存在但無(wú)蛋白表達(dá)，說(shuō)明該分子在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平可能丟失了該表位。用針對(duì)不同糖基化表位的CD133抗體對(duì)同一樣本中CD133蛋白進(jìn)行檢測(cè)時(shí)也會(huì)出現(xiàn)差異［16］，這也暴露了抗體檢測(cè)的不準(zhǔn)確性。⑥此外CD133不僅在細(xì)胞膜上表達(dá)還可以在胞漿中少量表達(dá)［17］，當(dāng)其定位于后者，有可能在流式細(xì)胞技術(shù)或免疫磁珠方法分選時(shí)被誤認(rèn)為是CD133（－）細(xì)胞。

直接用抗體來(lái)檢測(cè)CD133表達(dá)存在局限性，其結(jié)果可能把CD133（＋）GSCs誤認(rèn)為CD133（－）GSCs，因此聯(lián)合轉(zhuǎn)錄水平更有利于CD133（－）GSCs的研究。Beier［2］、Lottaz［9］認(rèn)為：一部分CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞無(wú)論是在基因還是蛋白水平都未出現(xiàn) CD133表達(dá)但確有 GSCs特征。Wang等［4］也從基因水平證實(shí)了一部分CD133（－）膠質(zhì)瘤細(xì)胞在不斷演進(jìn)中能獲得CD133的表達(dá)。這些結(jié)果彌補(bǔ)了使用抗體對(duì)CD133蛋白檢測(cè)的局限性，而且證實(shí)了CD133（－）GSCs的真實(shí)存在。

4 CD133（－）GSCs標(biāo)志物探索

CD133和Nestin以“兩點(diǎn)一線”的方式成為了GSCs的標(biāo)志物，但如今CD133（－）GSCs的出現(xiàn)卻使得通過(guò)CD133來(lái)鑒定GSCs變得局限。因此需要一個(gè)更具權(quán)威的標(biāo)志物聯(lián)合Nestin對(duì)GSCs進(jìn)行分選。

A2B5是位于細(xì)胞膜表面的神經(jīng)節(jié)苷酯，在NSCs上可表達(dá)，其陽(yáng)性的細(xì)胞具有分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能。通過(guò)分離得到的A2B5（＋）腫瘤細(xì)胞無(wú)論CD133表達(dá)如何都能形成“腫瘤球”，并且103數(shù)量級(jí)的該細(xì)胞就具有致瘤性，而A2B5（－）腫瘤細(xì)胞卻不能［18］。但也有數(shù)據(jù)顯示，A2B5（＋）腫瘤細(xì)胞在整個(gè)腫瘤成分中占有很大比例［19］，這與“CSCs只是腫瘤中一小部分群體”的概念相矛盾，可能GSCs只是包含于A2B5（＋）腫瘤細(xì)胞中的一部分群體。

SoX2（SRY-related homoebox transcription factor 2）是維持干細(xì)胞全能性的轉(zhuǎn)錄因子，且和CD133相似隨著分化成熟其表達(dá)下調(diào)，已被作為NSCs的標(biāo)志物。它也能夠在膠質(zhì)瘤中分選出的腫瘤球中表達(dá)［20］。Annovazzi等［21］發(fā)現(xiàn)，SoX2（＋）膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制分化、無(wú)限增殖和致瘤性。但真正使用SoX2來(lái)進(jìn)行GSCs分離并驗(yàn)證其可靠性的報(bào)道卻很少，因此需要更多的研究進(jìn)行指導(dǎo)。

側(cè)群細(xì)胞 （side population cell，SP cell）是用DNA染料Hoechst33342對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色后出現(xiàn)的染色偏低的群體。目前文獻(xiàn)大多停留在CD133（＋）GSCs與SP細(xì)胞之間的相關(guān)性研究，這對(duì)研究CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs是否同時(shí)包含于SP細(xì)胞產(chǎn)生了局限。并非所有SP細(xì)胞都存在于“腫瘤球”中，而非SP細(xì)胞的自我更新能力和致瘤性可能更強(qiáng)且能轉(zhuǎn)化為SP細(xì)胞［22］，說(shuō)明在非SP細(xì)胞中可能也存在部分GSCs。

雖然目前還沒(méi)有足夠的證據(jù)表明上述幾個(gè)標(biāo)記物能夠包含整個(gè)GSCs的不同亞型，但可以聯(lián)合Nestin為尋找更加特殊的標(biāo)記物和靶向治療GSCs打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

5 展望

依據(jù)CD133（＋）GSCs作為標(biāo)記物已產(chǎn)生了許多針對(duì)其靶點(diǎn)的治療方法，雖然療效有所改善但結(jié)局仍不盡如意。CD133（－）GSCs的提出不但解釋了這一現(xiàn)象的本質(zhì)，而且加深了人們對(duì)CSCs復(fù)雜多樣性的認(rèn)識(shí)。在膠質(zhì)瘤中可能只存在兩種GSCs，即CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；又或者在 CD133（－）GSCs中還存在多種不同亞型。根據(jù)全文所述，值得注意的是單憑針對(duì)CD133（＋）GSCs靶點(diǎn)的策略并不能實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)GSCs的殺滅，因此探索一個(gè)更為理想化的特異性標(biāo)記物對(duì)GSCs進(jìn)行篩選將成為對(duì)其全面認(rèn)識(shí)的關(guān)鍵，并最終達(dá)到治愈膠質(zhì)瘤的目標(biāo)。

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2011－08－23）

（責(zé)任編輯：甘章平）

10.3969／j.issn.1002－0152.2012.01.016

* 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科（重慶 400010）