利福平對魚藤酮誘導大鼠的抗多巴胺神經元凋亡作用

張國華 徐杰 吳達榮 陶恩祥

研究表明，散發(fā)性帕金森病(Parkinson’s disease，PD)可能與遺傳因素和環(huán)境因素共同作用有關[1-2]，其中環(huán)境因素占了十分重要的地位。 魚藤酮作為一種環(huán)境毒素，和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四 氫 吡 啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)一樣能誘導大鼠黑質多巴胺神經元(dopamine，DA)受損、缺失，十分適合用于 PD 動物模型的制作[3]。

在PD治療方面，近年來被廣泛開展的外科治療近期療效不錯[4]，但只是治標不治本，遠期療效尚不確切。然而，如何阻止DA神經元凋亡則被看作是根治PD的新方向。據報道，利福平除具有抗結核等作用外，還具有抗氧化應激及抗神經元凋亡的作用，從而提示利福平可能具有治療PD的作用[5]。我們之前的研究已證實，利福平在體外和體內均具有保護DA神經元的作用[6-7]，但利福平在體內保護神經元的作用是否通過對抗細胞凋亡而實現卻還沒明確。

本實驗是在上述的研究結果基礎上，通過魚藤酮誘導 Sprague-Dawley(SD)大鼠出現 DA神經元的凋亡，從而觀察利福平在活體內的抗神經元凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性SD大鼠72只(清潔級，中山大學實驗動物中心提供)，體質量250～300 g。將大鼠隨機分成五組，正常對照組及利福平(MD公司)對照組各12只，魚藤酮(Sigma公司)組、利福平治療組及利福平預防組各16只。正常對照組、利福平對照組及魚藤酮組分別每天給予背部皮下注射葵花油(Sigma 公司)1 mL／(kg·d)、利福平灌胃及背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液；利福平治療組在給予魚藤酮1周后開始同時給予魚藤酮和利福平；利福平預防組在給予魚藤酮的前3 d每天先給予利福平灌胃，然后每天同時給予魚藤酮和利福平。以上各組總的處理時間均為3周；魚藤酮在葵花油乳化液中的濃度為1.5 mg／mL，給藥劑量為1.5 mg／(kg·d)； 利福平在生理鹽水中的濃度為 5 mg／mL，給藥劑量為 30 mg／(kg·d)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠處死及標本采集 于第3周末分別處死各組大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露心臟，經左心室快速灌注冰鹽水100 mL，持續(xù)灌注冰4%多聚甲醛-PBS100 mL，斷頭取腦，4%多聚甲醛-PBS固定過夜，冠狀切斷包含黑質的腦組織(前囟尾側4.6～6.2 mm)，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

1.2.2 原位末端標記法(Tunel)(R＆D 公司)檢測凋亡 中腦石蠟切片脫蠟回水，NeuroPore室溫處理后去DNA酶水漂洗，陽性對照組用TACS核酸酶孵育30 min，室溫下抑制5 min，末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)標記緩沖液5 min，標記反應混和液37℃孵育1 h，TdT終止緩沖液室溫下5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，鏈霉親和素-辣根過氧化物(DAB)酶室溫下10 min復染，脫色，封片，光鏡下觀察黑質區(qū)凋亡情況。

1.2.3 黑質 Bax、Bcl-2 和 Caspase3 免疫組化檢測切片脫蠟回水后微波熱修復抗原，辣根過氧化物酶(HRP)阻斷劑阻斷30 min，分別4℃孵育兔抗鼠Caspase-3 多克隆抗體(Chemicon 公司)(1∶100)、兔抗鼠 Bax 多克隆抗體(Santa Cruz公司)(1∶100)、兔抗鼠 Bcl-2 多克隆抗體(Santa Cruz 公司)(1∶100)過夜，HRP 標記羊抗兔二抗(Boster公司)(1∶100)室溫孵育2 h，DAB顯色，復染，脫水、透明、烘干，中性樹膠封片后鏡下觀察。

1.2.4 圖像分析 經 Tunel及 Bax、Bcl-2和 Caspase-3免疫組化染色后的切片(每組中5個大鼠同一層面的中腦黑質切片)在Imagepro-Plus5.1系統(tǒng)下，每張切片取3個不同的視野進行Tunel及Bax、Bcl-2和Caspase-3陽性細胞數的計算，每一張Tunel染色切片放大400倍進行觀察和分析，每一張免疫組化染色切片放大200倍進行觀察和分析，陽性細胞計數的單位是個／mm2。

1.3 統(tǒng)計學方法 Tunel及 Bax、Bcl-2和 Caspase-3陽性細胞數均采用(x±s)表示，應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，5組大鼠以上4種陽性細胞數均數的比較均采用單因素方差分析，處理組之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 大鼠中腦黑質凋亡細胞數目的比較 如表1、圖1所示，Tunel檢測結果顯示，兩對照組的大鼠黑質凋亡細胞數在統(tǒng)計學上無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；與兩對照組相比，其余3組的大鼠黑質凋亡細胞數均明顯增多，且有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，而黑質凋亡細胞數在其余3組間的兩兩比較也均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。

表1 Tunel及 Bax、Bcl-2、Caspase3 陽性細胞數(400 ×，200 × )(個 ／mm2)

圖1 大鼠中腦黑質凋亡細胞(Tunel，胞質呈棕褐色為陽性)(400×)

圖2 大鼠中腦黑質Bax、Bcl-2和Caspase3陽性細胞(DAB染色，胞質呈棕褐色為陽性)(200×)

2.2 大鼠中腦黑質 Bax、Bcl-2和 Caspase-3的陽性細胞數的比較 如表1、圖2所示，兩對照組的大鼠黑質的Bax、Bcl-2和Caspase-3陽性細胞數在統(tǒng)計學上無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；與兩對照組相比，其余3組的大鼠黑質Bax及Caspase-3陽性細胞數均明顯增多而Bcl-2陽性細胞數均明顯減少，且3組中的這3個指標均與兩對照組間有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，而這3個指標在其余3組中的兩兩比較也均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。

3 討論

近年來，隨著神經生化技術的發(fā)展，人們發(fā)現PD的發(fā)生與細胞凋亡存在密切關系。研究表明，各種因素導致的PD最終都經過黑質DA神經元大量凋亡這一共同通路[8]。線粒體、氧化應激及α-synuclein是整個凋亡過程中的關鍵因素。在PD患者黑質DA神經元內，線粒體功能異常和氧化應激可使α-synuclein發(fā)生異常聚集，而α-synuclein的異常聚集反過來影響線粒體的功能，從而形成惡性循環(huán)，最終導致細胞凋亡和PD的發(fā)生[9]。

在蛋白水平上，與PD細胞凋亡關系最為密切的是Bcl-2蛋白家族的Bcl-2(抑細胞凋亡)和Bax(促細胞凋亡)兩種蛋白。研究發(fā)現，細胞內Bcl-2和Bax的比值對凋亡的發(fā)生起到重要調節(jié)作用[10]。同時，在PD患者黑質細胞發(fā)生凋亡的過程中caspase級聯(lián)反應是必不可少的環(huán)節(jié)[11]。上述發(fā)現提示，黑質DA神經元凋亡的核心環(huán)節(jié)可能是各種因素的作用下導致Bcl-2和Bax的比例下降及Caspase-3的激活并最終引起細胞凋亡。

魚藤酮是一種人類容易少量長期接觸的環(huán)境毒素，其可直接通過血腦屏障抑制腦組織的線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的活性[12]。由于DA神經元對能量障礙特別敏感，因此低劑量的魚藤酮在不影響其他部位細胞線粒體功能的情況下卻可引起DA神經元的凋亡[13]。另有研究顯示，魚藤酮最終通過調節(jié)Bcl-2和Bax的比例并激活caspase來誘導細胞凋亡[14]。

有學者提出，利福平之所以同時具有透過血腦屏障抑制氧化應激和神經細胞凋亡的作用，是由于其結構式中有一個連有脂肪鏈的萘氫醌環(huán)[5]。利福平經口服后在大鼠腦中濃度可達到血藥濃度的 13%[15]，能有效作用于大鼠中樞神經系統(tǒng)[16]。 而本課題組已通過實驗發(fā)現，利福平可在體外對抗MPP+誘導的PC12細胞凋亡[6]，但此作用在活體身上卻還沒得到證實。

在本研究中，我們選擇了魚藤酮來誘導SD大鼠出現中腦黑質DA神經元的大量凋亡，并同時應用利福平經胃給藥以抗凋亡，通過檢測凋亡細胞數及Bax、Bcl-2和Caspase-3的免疫活性變化以觀察利福平是否具有抑制魚藤酮誘導的細胞凋亡的作用。實驗結果發(fā)現：①低劑量慢性暴露于魚藤酮后，大鼠黑質的凋亡細胞明顯增多，而同時給予利福平灌胃的大鼠黑質凋亡細胞比僅給予魚藤酮的大鼠明顯減少；②低劑量慢性暴露于魚藤酮后，大鼠黑質部位Bax、Caspase-3表達增多而Bcl-2表達減少，而同時給予利福平灌胃的大鼠黑質的上述變化均有所減輕；③預防性使用利福平所起的抗凋亡作用較治療性使用利福平更顯著。因此，我們得出以下結論：①魚藤酮在活體內是通過誘發(fā)細胞凋亡途徑來引起DA神經元的大量丟失的，而利福平則在活體內具有對抗魚藤酮誘導的細胞凋亡的作用；②魚藤酮在活體內通過下調Bcl-2和Bax的比值、激活caspase通路來誘導DA神經元凋亡發(fā)生的，而利福平在活體內可通過上調Bcl-2和Bax的比值、抑制caspase通路來實現抗魚藤酮誘導的細胞凋亡的作用；③應用利福平的起始時間越早、持續(xù)時間越長，對抗細胞凋亡的作用越明顯。

總的來說，本研究不但成功地模擬了環(huán)境毒素(線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ)在活體內誘發(fā)大量DA神經元發(fā)生凋亡的過程，驗證了這類毒素引起細胞凋亡發(fā)生的通路，而且進一步證實了利福平具有抑制環(huán)境毒素誘導的多巴胺神經元凋亡的作用，闡明了其抗凋亡作用的實現途徑。這些重要發(fā)現使利福平應用于治療人類PD的想法由空想變成可能，為在PD的治療上獲得重大突破邁出了堅實的一步。

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